梁佳園，劉洋，韓鴻宇，張艷敏，張永剛，伏廣好，董學前*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），食品科學與工程學部，山東 濟南 250353；2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東 濟南 250013；3.內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070）

黃單胞菌細胞呈直桿狀，具有單端極生鞭毛，屬于革蘭氏陰性菌、好氧[1-4]。在自然界中，黃單胞菌通常對植物具有致病性，因而導致了多種重要經(jīng)濟作物出現(xiàn)黑腐病[5-6]。然而，在工業(yè)上應用黃單胞菌菌株生產(chǎn)微生物多糖，例如野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc）。該菌株可以生產(chǎn)一種水溶性胞外多糖，稱為黃原膠，因其具有較好的觸變性和增稠性，可以作為增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，廣泛應用于石油工業(yè)、食品、飲料、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域。

菌黃素是黃單胞菌產(chǎn)生的一種不溶于水的黃色色素，最初被認為是一種類胡蘿卜素[7]，后經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)菌黃素的化學成分是溴化芳基多烯脂的衍生物，牢固地附著在細胞外膜上[8]。來自不同黃單胞菌的菌黃素在溴化和甲基化上有所不同[9]。菌黃素在黃單胞菌中是一種致病因子，并對菌株胞外多糖的合成、繁殖能力、抗氧化能力以及呼吸鏈中輔酶Q8的合成有一定影響[10-12]。因此，透徹理解菌黃素的合成機制對研究黃單胞菌有重要意義。

由于菌黃素的存在，在提取野油菜黃單胞菌的產(chǎn)物黃原膠的過程中需要使用大量溶劑脫色。該過程耗能大，成本較高，工藝復雜，甚至會影響黃原膠的產(chǎn)量。目前的研究結(jié)果表明，通過連續(xù)傳代、誘變劑和基因工程等方法能夠獲得低色素的黃原膠。Poplawsky等[13-14]在Xcc中克隆了菌黃素生物合成的基因簇，鑒定其含7個轉(zhuǎn)錄單元。Xcc分離株ATCC33913基因組序列發(fā)表后，菌黃素生物合成基因簇（Xcc3998-Xcc4015）也隨之被鑒定[15]。菌黃素生物合成受到了擴散因子（diffusible factor，DF） 的調(diào)控，Xcc4014（命名為XanB2）參與DF的生物合成[16]。He等[17]發(fā)現(xiàn)DF是菌黃素的合成前體3-羥基苯甲酸（3-hydroxybenzoic acid，3-HBA）；Zhou 等[18]鑒定了 XanB2 為一種獨特的分支酸裂解酶，以分支酸為底物同時合成3-HBA和4-羥基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，4-HBA）；Cao等[19]敲除了菌黃素合成基因簇中所有基因，分析了所有突變體的菌黃素生物合成，鑒定了XanA2為?；?酰基載體蛋白合成酶（Aas S），與酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）Xan C一起激活 3-HBA合成 3-HBA-S-ACP，進入II型聚酮合酶生物合成途徑，合成芳香多烯鏈。Cao等[19]也發(fā)現(xiàn)Fab G家族蛋白Xan H和新型糖基轉(zhuǎn)移酶Xan K也參與菌黃素的生物合成。Yu等[20]通過基因敲除發(fā)現(xiàn)Xan H（Xcc4003）不僅參與菌黃素生物合成，還參與了擴散信號因子（diffusible signal factor，DSF）的生物合成。野油菜黃單胞菌中的pig基因簇和菌黃素有密切的關(guān)系，該基因簇的Xcc4000（xanK）被鑒定為糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶對菌黃素的生物合成具有必不可少的作用。大多數(shù)研究集中于菌黃素的生物合成途徑[21]，但菌黃素的具體合成機制還有待進一步深入研究。

在研究過程中得到一株自然突變的無黃色素黃原膠的XW菌株，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)在pig基因簇中xanK基因一處堿基由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔瑸榱蓑炞C該突變位點的作用，構(gòu)建帶xanK的回補質(zhì)粒，將其導入XW菌株中，觀察導入回補質(zhì)粒后XW菌株的顏色變化，分析突變菌株和野生型菌株產(chǎn)物黃原膠之間的差異。本研究中針對堿基位點進行的相關(guān)研究不僅可以定位影響酶活性的關(guān)鍵堿基，還可以進一步的闡述xanK基因?qū)S素合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

野油菜黃單胞菌XCl菌株、野油菜黃單胞菌突變菌株XW、大腸桿菌DH5α菌株、廣宿主穿梭質(zhì)粒pBBR1MCS-2：山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院保存。

1.1.2 酶與試劑

酵母粉、胰蛋白胨（分析純）：英國Oxoid公司；蛋白胨（分析純）：南通東海龍生生物制品有限公司；酵母膏（分析純）：安琪酵母股份有限公司；牛肉膏（分析純）：北京奧博星生物科技有限公司；NaCl（分析純）：天津化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（生化試劑）：天根生化科技（北京）有限公司；Fastpfu DNA Polymerase（生化試劑）：北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基：5 g/L 酵母粉、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl。

HYG培養(yǎng)基：10 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、0.5 g/L酵母膏、2 g/L NaCl，pH7.0，可加入15 g/L瓊脂粉配制為固體HYG培養(yǎng)基。

HYS培養(yǎng)基：20 g/L蔗糖、5 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、0.5 g/L 酵母膏、2 g/L NaCl，pH7.0，可加入 15 g/L 瓊脂粉配制為固體HYS培養(yǎng)基[10]。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃下高壓滅菌20min。

卡那霉素（Kanamycin，Kana）（50 mg/mL）：卡那霉素0.500 g，超純水10 mL，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-20℃儲存。

1.2 儀器與設(shè)備

T960 PCR擴增儀：耶拿分析儀器股份公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：杭州奧盛儀器有限公司；5804R冷凍離心機：美國艾本德公司；DW-86L416G超低溫冰箱：青島海爾公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYY-7C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Gel Doc凝膠成像儀、MicroPulser電穿孔儀：美國伯樂公司；ZQZYCF9.9恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；HCB-900V智凈潔凈工作臺：上海甄明科學儀器有限公司；DV-2T旋轉(zhuǎn)黏度計：美國博勒飛公司；1260 Infinity II GPC/SEC：安捷倫科技公司；DLAB OS20-S攪拌器：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的構(gòu)建

1.3.1.1 引物設(shè)計

引物設(shè)計見表1。

表1 引物Table 1 Primers

1.3.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將保藏菌株XCl接入HYG培養(yǎng)基中，放置于搖床30℃，200 r/min轉(zhuǎn)接培養(yǎng)24 h，然后按相同步驟再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)1次。參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，獲得XCl的基因組DNA，置于-20℃冰箱保藏。

使用FastPfu DNA Polymerase對xanK基因進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，總體系100 μL，反應體系與PCR程序見表2。

表2 PCR擴增體系Table 2 PCR amplification system

PCR擴增程序：95℃預變性5 min，循環(huán)程序（95 ℃ 變性 30 s，60 ℃ 退火 25 s，72 ℃ 延伸 20 s），運行35次，后延伸72℃，5 min。瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增產(chǎn)物，驗證正確的條帶使用膠回收試劑盒回收，具體參照試劑盒說明書步驟進行?；厥盏玫降漠a(chǎn)物測定濃度后，置于-20℃冰箱保存。

以野生型菌株XCl的基因組為模板，使用引物對xanK-F和xanK-R，用高保真酶FastPfu進行PCR擴增xanK基因回補片段。擴增的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳回收得到xanK片段，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NheI雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pBBR1MCS2[22]。將得到的xanK片段使用T5連接酶與線性載體pBBR1MCS2連接，轉(zhuǎn)化至DH5α菌株中。挑選出在加了卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基上長出來的大腸桿菌，做PCR驗證。將條帶大小符合的片段回收，做雙酶切驗證和測序驗證。篩選出雙酶切結(jié)果中堿基數(shù)匹配的質(zhì)粒做進一步測序驗證。將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫上進行序列比對，挑選出構(gòu)建成功的pBBR1MCS2-xanK質(zhì)粒。

1.3.1.3 xanK基因測序

在倒置培養(yǎng)14 h～16 h的含有卡那霉素的LB平板中挑取單菌落，驗證轉(zhuǎn)化子，具體步驟如下：1）在超凈工作臺中取若干高溫滅菌后的PCR管，每管中加入10 μL無菌生理鹽水；2）移液槍槍頭挑取LB平板中的轉(zhuǎn)化子菌落，然后槍頭插入含有生理鹽水的PCR管中，吹吸3次～5次，將單菌落收集到PCR管中；3）按照表2中PCR方法對已挑取的轉(zhuǎn)化子單菌落進行PCR鑒定，模板的加入需要在潔凈工作臺中進行，PCR總體系為25 μL，程序相同；4）瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，驗證正確的轉(zhuǎn)化子從PCR管中接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下，200 r/min培養(yǎng)16 h；5）使用質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)完成的菌液中的質(zhì)粒，方法按照說明書要求進行，隨后送至相關(guān)公司測序。

1.3.1.4 xanK基因回補菌株[XW（xanK）]的構(gòu)建

制作XW菌株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，用電擊轉(zhuǎn)化法將回補質(zhì)粒pBBR1MCS2-xanK導入到XW菌株中，涂布在含有卡那霉素的抗性平板上，挑選長出的單菌落，進行下一步的驗證試驗。

1.3.1.5 xanK基因回補菌株的驗證

XW、XW（xanK）和XCl菌株在HYG培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h，菌液5 000 r/min離心3 min，觀察沉淀的顏色。

1.3.2 菌黃素提取、純化和定性定量分析

XW和XCl菌株于HYS培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)72 h，分別收集10 mL菌液，8 000 r/min離心5 min去除上清液，加入1 mL無水乙醇，渦旋使菌體充分懸浮。將含有懸浮液的離心管置于95℃水浴鍋中水浴5 min，10 000 r/min離心10 min，取600 μL上清液，利用分光光度計測定上清液441 nm處吸光值，對菌黃素定量分析。將XW、XW（xanK）和XCl菌株在HYG培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h，取菌液5 000 r/min離心3 min，對比XW、XW（xanK）和XCl菌液離心后菌體的顏色，對菌黃素定性分析。

1.3.3 黃原膠提取與定量分析

XW和XCl菌株于HYG培養(yǎng)基中30℃發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束后取1 mL發(fā)酵液稀釋10倍，90℃水浴1 h，使用硅藻土趁熱過濾去除菌體，收集濾液。提前準備干凈的50 mL離心管，收集上清液，向濾液中緩慢加入95%的乙醇，邊加邊攪拌，直至有絮狀沉淀產(chǎn)生，收集沉淀，再次使用95%的乙醇清洗。-20℃中放置30 min，4℃、10 000 r/min離心10 min后倒去上清液，在60℃下干燥6 h，稱量干燥后的黃原膠質(zhì)量計算黃原膠產(chǎn)量。

1.3.4 乙?；捅岷繙y定

參照Cheetham等[23]的方法測定不同黃原膠樣品的乙?；捅浚撼兯渲? g/L的黃原膠溶液，取1 mL此溶液與1 mL的0.1 mol/L磷酸混合，密封于90℃下反應90 min，取反應液定容至5 mL，0.22 μm濾膜過濾，得到丙酮酸測定液。取1 mL的5 g/L黃原膠溶液與1 mL的0.2 mol/L KOH混合，沖入氮氣后密封，45℃下反應6 h，反應結(jié)束后使用磷酸溶液（0.1 mol/L，1 mL）中和，使用超純水精確定容至 5 mL，0.22 μm 濾膜過濾得到乙?；鶞y定液。

采用不同濃度的丙酮酸溶液（0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 mg/mL）和乙酸溶液（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL），繪制標準曲線。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 測定乙?；c丙酮酸含量，具體參數(shù)：AminexHPX87H有機酸分析柱，柱溫60℃，紫外檢測器，檢測波長210 nm，流動相為5 mmol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min。計算公式如下。

式中：γ為HPLC測定的丙酮酸含量，g/L；λ為HPLC測定的乙酸含量，g/L；a為稀釋倍數(shù)；b為測定液濃度，g/L；M1為乙酰基摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為乙酸摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.3.5 黃原膠分子量測定

使用凝膠滲透色譜法測定各黃原膠的分子量[24]，蒸餾水配制濃度為1 g/L的黃原膠溶液，10 000 r/min離心30 min，使用0.22 μm膜過濾以制備樣品。使用Agilent 1260 Infinity II GPC/SEC系統(tǒng)測定分子量，配有示差折射檢測器和多角度激光散射檢測器。流速1 mL/min，柱溫30℃，流動相為1 g/L的NaNO3溶液，流速1 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗進行3個平行，采用Excel2016對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析；利用Origin 2021和Adobe Illustrator CS6繪圖軟件處理試驗數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 xanK基因回補菌株的構(gòu)建

xanK片段膠回收驗證見圖1。

圖1 xanK片段膠回收驗證Fig.1 xanK fragment glue recovery verification

xanK片段大小為822 bp，圖1中電泳結(jié)果顯示得到一條位于800 bp與1 000 bp之間的條帶即xanK。根據(jù)這一結(jié)果擴大PCR體系對xanK膠回收。

重組質(zhì)粒的雙酶切驗證結(jié)果見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切驗證Fig.2 Verification of double digestion of the recombinant plasmid

2.2 xanK基因回補菌株的鑒定

對比XW、XW（xanK）和XCl菌株培養(yǎng)基離心后菌體的顏色，發(fā)現(xiàn)菌株XW（xanK）的顏色由白色變成了黃色，證明xanK基因突變導致無黃色素黃原膠的產(chǎn)生。改造菌株、突變菌株和野生型菌株顏色對照見圖3。

圖3 改造菌株、突變菌株和野生型菌株顏色對照Fig.3 Color comparison of modified strain，mutant strain and wild-type strain

2.3 菌黃素含量

為了研究菌株XW和XCl菌黃素的合成情況，選擇發(fā)酵72 h的菌液分別提取測定菌黃素含量，結(jié)果見圖4。

圖4 菌黃素含量Fig.4 Lutein content

由圖4可知，72 h時，菌株XCl和菌株XW的OD441水平分別為0.37和0.05，菌株XW和菌株XCl的OD441值相比較，發(fā)現(xiàn)菌株XW的OD441水平比菌株XCl降低了86.5%。由上述結(jié)果可知，xanK基因的存在，導致菌黃素的合成受阻，進而影響菌黃素的合成。

2.4 黃原膠性質(zhì)

為了驗證xanK突變菌株對黃原膠產(chǎn)量及性質(zhì)的影響，進行了搖瓶發(fā)酵驗證，兩種黃原膠的基本性質(zhì)見表3。

由表3可知，發(fā)酵72 h后，菌株XW發(fā)酵液黏度為8 930 mPa·s，比菌株 XCl提升了17.8%，菌株XW黃原膠的產(chǎn)量和黏度分別為3.28 g/100 g和1 326 mPa·s，分別比菌株XCl提升了10.4%、5.3%，分子量為3.67×106Da，比菌株XCl降低了80.2%。

表3 兩種黃原膠的基本性質(zhì)Table 3 Basic properties of the two xanthan gums

2.5 黃原膠的丙酮酸和乙?；?/h3>

研究表明，黃原膠分子結(jié)構(gòu)側(cè)鏈上的乙酰基與丙酮酸含量會影響黃原膠溶液性能[25]。乙酰基和丙酮酸在黃原膠分子鏈上的分布并無規(guī)律，但對黃原膠的構(gòu)象及物化性質(zhì)卻有很大的影響[26-27]。丙酮酸化可增加黃原膠黏度，乙酰化可降低黃原膠黏度[28]。乙?；鶊F的存在加強了分子內(nèi)的相互作用力，因為脫去乙?；笫裹S原膠分子變得更加柔順[29]。高效液相色譜法測定黃原膠中乙?；捅岷康慕Y(jié)果見圖5。

圖5 乙?；捅岷孔兓疐ig.5 Change of acetyl group and pyruvate content

由圖5可知，在xanK基因突變后，其黃原膠產(chǎn)物中丙酮酸含量為1.45%，比菌株XCl增加了74.70%，在xanK基因突變后，其黃原膠產(chǎn)物中乙酰基含量為6.52%，比菌株XCl降低了8.94%，無黃色素黃原膠分子側(cè)鏈上乙?；柯缘陀邳S原膠。

3 結(jié)論

為研究xanK突變對菌黃素合成的影響，通過構(gòu)建回補菌株XW（xanK）來驗證這一突變位點的影響，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒導入白色菌株XW中，發(fā)現(xiàn)菌株由白色變?yōu)辄S色，證實了xanK基因突變導致了黃原膠變?yōu)闊o黃色素黃原膠。搖瓶發(fā)酵對比白色菌株和野生型黃色菌株的黃原膠產(chǎn)生水平，菌株XW發(fā)酵液黏度為8 930 mPa·s，比菌株XCl提升了17.8%，菌株XW黃原膠的產(chǎn)量和黏度分別為3.28 g/100 g和1 326 mPa·s，分別比菌株XCl提升了10.4%、5.3%，分子量為3.67×106Da，比菌株XCl降低了80.2%，菌株XW菌黃素水平相比于XCl下降了86.5%。本研究中的突變菌株有利于提高黃原膠產(chǎn)量，且產(chǎn)生的菌黃素更少，方便后續(xù)的提取工作，降低了黃原膠的生產(chǎn)成本。