韓 笑，龐俊增，李林岳，王亞楠，范國英，李任峰，王自良

(河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是一種急性、高度接觸性豬腸道傳染病，病豬以嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征，新生仔豬的發(fā)病率和病死率可達100%[1-2]。PED最早發(fā)生于歐洲[3]，我國于1984年首次報道，2010年之前以散發(fā)為主[4]。自2010年12月開始，PEDV變異毒株在全球多個國家暴發(fā)流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[5]。而且，隨著病毒的不斷演化，PEDV的防控形勢變得越來越嚴(yán)峻[6]。

PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，是一種直徑約為90 nm～120 nm、有囊膜的單股正鏈RNA病毒[7]。PEDV的基因組長度約為28 kb，至少包含7個開放閱讀框，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白(spike，S)、核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)、膜蛋白(membrane，M)和囊膜蛋白(envelope，E)，以及3種非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a、1b和ORF3)[8-9]。其中，N蛋白為病毒形成螺旋狀衣殼提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫。而且，在PEDV感染的早期，豬體內(nèi)即可檢測到高水平的抗N蛋白抗體[10]。因此，N蛋白可以作為PEDV早期檢測的重要靶點[11]。本研究開展了PEDV N蛋白的抗原表位分析，研制了基于N蛋白抗原表位的單克隆抗體，為研究N蛋白的生物學(xué)功能以及建立PEDV免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系、實驗動物 骨髓瘤細(xì)胞(NS0)由河南科技學(xué)院動物病毒病防控重點實驗室保存；雌性Balb/c小鼠，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺(3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB)顯色底物緩沖液、聚乙二醇1500融合劑(polyethylene glycol 1500，PEG1500)、次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養(yǎng)基添加劑(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷混合物培養(yǎng)基添加劑(hypoxanthine & thymidine，HT)，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基，北京索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清，美國BI公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(goat anti mouse IgG-horseradish peroxidase，GaMIgG-HRP)、山羊抗小鼠IgG-異硫氰酸熒光素結(jié)合物(goat anti mouse IgG-fluorescein isothiocyanate，GaMIgG-FITC)、單克隆抗體亞類鑒定試劑盒，北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 MK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；TI-DH光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；Galaxy S+型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Biotech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PEDV N蛋白B細(xì)胞表位的生物信息學(xué)分析 從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得PEDV(CH/HNQX-3/14，GenBank登錄號：KR095279)N蛋白的氨基酸序列。采用DNA Star Protean軟件并結(jié)合IEDB(http://www.tools.ideb.org.main/)在線工具對N蛋白的親水性(hydrophilicity)、抗原性(antigenicity)、表面可及性(surface accessibility)、二級結(jié)構(gòu)等進行分析，將可信度較高的氨基酸片段確定為PEDVN蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞表位[12-13]。多肽合成由上海吉爾生物公司在ABI 433型多肽合成儀上完成。

1.2.2 小鼠免疫 將人工合成的表位多肽與KLH偶聯(lián)制備免疫原，并與弗氏完全佐劑乳化后，以0.02 mg/只的劑量皮下多點注射6周齡～8周齡雌性Balb/c小鼠。間隔3周，用弗氏不完全佐劑乳化相同劑量的免疫原進行加強免疫。第3次免疫后7 d斷尾采血獲得每只小鼠的多抗血清。用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測抗表位多肽抗體滴度。選擇抗體滴度最高的小鼠，在細(xì)胞融合前3 d尾靜脈注射0.1 mg不含弗氏佐劑的免疫原進行加強免疫。

1.2.3 細(xì)胞融合 參考Kohler和Milstein建立的細(xì)胞融合技術(shù)[14]。選用PEG1500作為促融劑，以1∶5的比例將狀態(tài)良好的骨髓瘤細(xì)胞NS0與小鼠脾臟中的B細(xì)胞融合。融合細(xì)胞懸浮在預(yù)熱的HAT培養(yǎng)基中，接種于96孔板，并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天檢查細(xì)胞生長和集落形成情況。待集落長到孔底面積的二分之一左右時，通過間接ELISA測定其上清液中抗體滴度。選取抗體分泌水平較高的陽性細(xì)胞株，采用有限稀釋法進行亞克隆，篩選能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.4 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選抗體 將合成的表位多肽與雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)偶聯(lián)后用碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution，CBS)稀釋至2 μg/mL，加入到96孔酶標(biāo)板(50 μL/孔)，4 ℃過夜，用洗滌液[含有0.5 mL/L吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)]洗板5次，每孔加入150 μL 30 mg/mL BSA置于37 ℃封閉1 h，用PBST洗板5次，每孔加入50 μL細(xì)胞上清或腹水，同時設(shè)立無抗體陰性對照孔，37 ℃孵育30 min。PBST洗板5次后，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min，PBST洗板5次，每孔加入50 μL TMB底物顯色液，室溫避光顯色5 min，加入50 μL濃度為2 mol/L的硫酸終止液，利用酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光值。

1.2.5 免疫熒光分析 待96孔培養(yǎng)板中的單層Vero細(xì)胞長至70%左右，以每孔10 μL的劑量接種PEDV，37 ℃孵育40 min后加入200μL含20 mL/L胎牛血清的DMEM維持液。在感染病毒48 h后，棄去培養(yǎng)上清，用PBS洗滌5遍，然后用40 mg/mL多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗5遍后，每孔加入50 μL 10 mL/L triton X-100室溫孵育15 min，加入30 mg/mL的BSA溶液室溫封閉1 h。用PBS洗滌后加入陽性雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌5次，避光加入1∶200 PBS稀釋的GaMIgG-FITC結(jié)合物，37 ℃孵育40 min，PBS洗滌5次，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 小鼠腹水的制備 采用體內(nèi)誘導(dǎo)腹水法生產(chǎn)PEDV單克隆抗體[15]。取8周齡～10周齡的雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL無菌石蠟油，7 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞(約2×106/只)。待小鼠腹部隆起，收集腹水并在4 ℃下以10 000 r/min離心30 min去除油脂，通過辛酸硫酸銨沉淀法純化抗體。

1.2.7 抗體穩(wěn)定性及亞類鑒定 雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過6次凍存、復(fù)蘇傳代，使用1.2.4 ELISA方法檢測不同批次細(xì)胞上清抗體OD值，以確定雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性。用小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的亞類和型。操作如下：首先將50 μL/孔2 000倍稀釋的單克隆抗體添加到酶標(biāo)板中，37 ℃孵育15 min。PBST洗滌5次后，每孔加入50 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和κ鏈、λ鏈抗體，并在37 ℃孵育25 min，根據(jù)上述ELISA方法確定單克隆抗體的亞類和型。

1.2.8 抗體親和力分析 用Batty飽和法測定單抗的親和常數(shù)K(aff)[16]。將1 μg/mL和2 μg/mL的抗原分別包被于96孔板中，將抗體倍比稀釋，采用1.2.4間接ELISA法測定吸光值。以抗體濃度作為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)曲線。親和常數(shù)K(aff)通過公式K(aff)=(n-1)/2(n[Ab']t-[Ab]t)計算，其中n=[Ag]t/[Ag']t，[Ag]t和[Ag']t分別表示不同抗原濃度，[Ab]t和[Ab']t分別表示不同濃度抗原對應(yīng)的抗體濃度。

2 結(jié)果

2.1 PEDV N蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測分析

利用DNA Star軟件中的Protean對N蛋白的親水性、柔韌性、抗原性指數(shù)和表面可及性進行分析，結(jié)合N蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，選取綜合得分最高的區(qū)域作為候選表位，最終確定PEDVN蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢表位為40-53 aa(PTNKGNKDQQIGYW)的肽段，將該表位命名為EP001(表1)。

表1 PEDV N蛋白表位分析結(jié)果

2.2 小鼠血清抗體效價測定

將表位多肽EP001與KLH偶聯(lián)作為免疫原，乳化后免疫接種小鼠，通過間接ELISA方法檢測小鼠血清效價。如圖1所示，4只小鼠產(chǎn)生的抗體效價均達到1∶1.28×104以上，其中3號小鼠的抗體效價相對較高，選擇3號小鼠用于細(xì)胞融合。

圖1 小鼠血清抗體效價檢測結(jié)果

2.3 細(xì)胞上清液和腹水中抗體水平的測定

細(xì)胞融合10 d左右觀察雜交瘤細(xì)胞克隆的生長情況，本研究中細(xì)胞融合率為85.16%。用有限稀釋法對生長良好、抗體水平較高的細(xì)胞株進行3次亞克隆，篩選出雜交瘤細(xì)胞株9C4。通過間接ELISA檢測雜交瘤細(xì)胞分泌抗體水平，9C4培養(yǎng)上清和腹水效價分別為3.2×102和5.12×104。

2.4 免疫熒光分析

將PEDV接種于鋪有Vero細(xì)胞的96孔板中，48 h后進行免疫熒光分析。將雜交瘤細(xì)胞上清作為第一抗體，使用GaMIgG-FITC結(jié)合物作為第二抗體，結(jié)果顯示，9C4細(xì)胞株分泌的抗體與PEDV反應(yīng)顯示明顯的綠色熒光，與未感染PEDV的Vero細(xì)胞無熒光信號，表明單克隆抗體9C4能夠與PEDV發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2)。

A.9C4與感染PEDV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生熒光信號；B.9C4與未感染PEDV的Vero細(xì)胞無熒光信號

2.5 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性和亞類的鑒定

將雜交瘤細(xì)胞株9C4經(jīng)過6次凍存、復(fù)蘇，測得的OD值均在1.6左右(圖3)，表明該雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體的能力具有良好的遺傳穩(wěn)定性。此外，對抗體的亞類及型分析結(jié)果顯示，該細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體為IgG2b亞類，輕鏈為κ型(圖4)。

圖3 9C4單克隆抗體穩(wěn)定性測定

圖4 9C4單克隆抗體亞類和型的鑒定

2.6 腹水單克隆抗體親和力測定

采用間接ELISA測定腹水單克隆抗體(9C4)的親和力。結(jié)果顯示，該抗體與抗原結(jié)合達到50%飽和所需的濃度為0.32 μg/mL。計算該抗體的相對親和力指數(shù)為1.88×107(moL/L)，表明其具有較好的親和性(圖5)。

圖5 9C4單克隆抗體親和常數(shù)分析

3 討論

單克隆抗體在PEDV的檢測和治療方面發(fā)揮重要作用，其制備方法在不斷發(fā)展和進步。傳統(tǒng)上采用PEDV全病毒作為免疫原研制其單克隆抗體。如丁壯等[17]將純化的PEDV免疫接種小鼠制備出PEDV特異性單克隆抗體，但PEDV分離困難，培養(yǎng)周期長，純化工藝復(fù)雜，大多數(shù)實驗室難以應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用重組蛋白作為抗原制備單克隆抗體的技術(shù)逐漸成熟，主要包括原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。其抗原制備具有成本低，耗時短的特點。但該技術(shù)目前仍存在表達蛋白穩(wěn)定性差、易受表達系統(tǒng)影響以及蛋白純化困難等問題。相比于傳統(tǒng)抗體分子，納米抗體穩(wěn)定性好，與抗原結(jié)合力強，免疫原性低。王天宇等[18]用原核表達、純化PEDV S1蛋白，免疫雙峰駝后，通過構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫，成功篩選出能與PEDV發(fā)生特異性結(jié)合的納米抗體。納米抗體在PEDV的檢測、治療以及致病機制研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景[19]。

采用生物信息學(xué)方法分析病毒抗原表位，并利用合成表位多肽制備抗體已經(jīng)成為當(dāng)前研制病毒抗體的重要方法[20]。其中，篩選最佳表位多肽是制備抗體的關(guān)鍵。汪偉等[21]以人工合成豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus virus type 2，PCV2)Cap蛋白表位多肽作為抗原免疫Balb/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞瘤雜交技術(shù)獲得了1株穩(wěn)定分泌抗PCV2 Cap蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。Wang A P等[22]設(shè)計了基于非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)p54蛋白N末端結(jié)構(gòu)域多肽，將其與BSA偶聯(lián)后作為免疫原，篩選出6株能與p54蛋白結(jié)合的單克隆抗體，其中5株能與HLJ/18毒株發(fā)生特異性反應(yīng)，并闡明了位于表位中的5FFQPV9為結(jié)合抗體的核心位點。以上研究表明基于合成表位制備單克隆抗體是可行的，隨著計算機信息技術(shù)和人工智能算法的發(fā)展，抗原表位預(yù)測的準(zhǔn)確性將大大提高，基于合成表位的抗體制備技術(shù)將成為未來研制克隆抗體的重要途徑。

本研究采用生物信息學(xué)工具分析PEDV N蛋白的抗原表位，將合成表位多肽和載體蛋白KLH偶聯(lián)制備免疫原。采用雜交瘤技術(shù)篩選出1株穩(wěn)定分泌PEDV抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為下一步建立PEDV免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。