胡馨勻，趙官正，孫焱森，權(quán) 希，張素華，何高明，2*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，上海 200240)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)在各種環(huán)境和動物體內(nèi)都廣泛分布，其耐藥問題已經(jīng)成為一項嚴峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[1]。豬大腸桿菌病可通過生物源以及環(huán)境源等途徑在生豬間發(fā)生和傳播。在養(yǎng)殖行業(yè)飼料全面禁抗之前，養(yǎng)殖戶為防止生豬發(fā)病，長期在飲水和飼料中添加抗菌藥物，加劇了大腸埃希氏菌耐藥性的產(chǎn)生及傳播。大腸埃希氏菌可通過基因突變、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生耐藥基因，也可以通過可移動片段獲得外源耐藥基因[2]。大腸埃希氏菌耐藥基因的擴散與傳播會導(dǎo)致抗菌藥物作用下降甚至消失，其耐藥基因可能通過食物鏈傳播，威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。本試驗分析新疆某規(guī)?；i場大腸埃希氏菌耐藥現(xiàn)狀，有針對性地提出豬場大腸桿菌病預(yù)防措施，為健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采集新疆某規(guī)模化豬場豬呼吸道分泌物80份、肛拭子80份、環(huán)境污水樣本80份，合計240份。

1.1.2 主要藥品及試劑 普通LB瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，購自杭州微生物研究所；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀，Techne公司產(chǎn)品；電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像儀，Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定 挑取樣本接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24h，經(jīng)分離純化多次得到大腸埃希氏菌純培養(yǎng)物，對其進行大腸埃希氏菌生化鑒定分析。

1.2.2 細菌藥物敏感性試驗 采用K-B藥敏紙片法進行藥物敏感性試驗，依據(jù)CLSI[11]所給出的敏感性范圍，計算細菌對藥物的敏感率和耐藥率。

1.2.3 PCR引物的設(shè)計 采用文獻報道引物。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因選擇：CTX-M[3]、OXA、TEM[4]；磺胺類：sul1、Sul2、Sul3[5]；四環(huán)素類：tetD、tetA、tetB[6]；氨基糖苷類：strA、strB、aadA[7]；喹諾酮類：qnrA、qnrB、qnrS、qepA[8]、aac(6′)-Ib[9]；酰胺醇類：floR[7]；林可胺類：ermC[10]。引物均由上海生工生物工程股份公司合成。

1.2.4 PCR擴增 反應(yīng)體系為：上、下游引物各1 μL，10 μL ddH2O，7 μL Mix，1 μL DNA。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次循環(huán)；72 ℃10 min終延伸，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。擴增結(jié)束后，進行電泳。根據(jù)PCR擴增結(jié)果計算分離菌株攜帶耐藥基因檢出率。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌的分離、鑒定

規(guī)模化豬場240份樣本分離得到182株疑似大腸埃希氏菌的菌株，進行生化鑒定試驗。182株分離株色氨酸肉湯反應(yīng)呈陽性；MR反應(yīng)為陽性，VP反應(yīng)為陰性；乳糖發(fā)酵反應(yīng)為陽性；西蒙氏枸櫞酸鹽、纖維二糖、硫化氫、氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)均為陰性；賴氨酸脫羧酶肉湯反應(yīng)為陽性，確定為大腸埃希氏菌。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

該豬場大腸埃希氏菌對青霉素、四環(huán)素耐藥，其次是林可霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、鏈霉素和磺胺甲惡唑；對頭孢噻呋鈉敏感，其次是慶大霉素、卡那霉素、氟苯尼考、氨芐西林(表1)。

表1 18種常見獸用抗菌藥物藥敏紙片法182株大腸埃希氏菌耐藥率統(tǒng)計表

2.3 細菌耐藥基因型檢測結(jié)果

耐藥基因型檢測結(jié)果見表2和圖1。其中tetB(96.2%)、floR(95.5%)、tetA(84.1%)、aadA(80.8%)、aac(6′)-Ib(72.0%)以及strA(70.9%)耐藥基因攜帶率較高，qnrS(68.1%)、ermC(59.0%)、sul3(57.1%)、qnrB(53.3%)、qnrA(51.6%)、qepA(49.5%)、tetD(48.9%)、strB(48.9%)、TEM(35.7%)、CTX-M(34.0%)次之，sul2(20.3%)、OXA(18.7%)和sul1(13.7%)最低。

表2 182株大腸埃希氏菌耐藥基因檢出率

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對照；2～4.aac(6′)-Ib擴增產(chǎn)物

3 討論

3.1 豬場大腸埃希氏菌耐藥表型結(jié)果分析

大腸埃希氏菌總體分離率達75.8%，藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌對頭孢噻呋鈉極其敏感，達100%，說明該藥對該豬場大腸桿菌病的治療仍能起到良好的效果，這與石大麗[1]的研究結(jié)果有差異，大腸埃希氏菌的耐藥情況與地區(qū)流行性和用藥習(xí)慣有關(guān)；對青霉素和四環(huán)素耐藥菌株比例高達100%，超過50%的大腸埃希氏菌對林可霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、鏈霉素和磺胺甲惡唑產(chǎn)生了耐藥性，說明這幾種藥物對該豬場大腸桿菌病治療效果較差。

3.2 大腸埃希氏菌耐藥基因檢測結(jié)果分析

β-內(nèi)酰胺類3種耐藥基因平均檢出率為29.47%，說明該養(yǎng)殖場已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的該耐藥基因污染；頭孢噻呋鈉的耐藥表型與基因檢測結(jié)果一致性較差，表明這些基因可能存在潛在耐藥性，甚至可能出現(xiàn)耐藥基因傳播現(xiàn)象，對防止細菌耐藥有重要作用[2]。

氨基糖苷類3種耐藥基因平均檢出率為66.87%，表明氨基糖苷類耐藥基因在養(yǎng)殖場內(nèi)分布廣泛，但與文娟等[7]的研究結(jié)果存在差異，反映出大腸埃希氏菌的耐藥基因攜帶率存在地區(qū)差異。

四環(huán)素類耐藥基因的平均攜帶率為76.4%，與其耐藥表型試驗結(jié)果一致，該結(jié)果與Boerlin P等[11]的研究結(jié)果一致，四環(huán)素類藥物的長期使用，加速了tetA、tetB等耐藥基因的出現(xiàn)和演變。

磺胺類耐藥基因的平均檢出率為30.37%，該試驗結(jié)果其耐藥表型試驗結(jié)果較為符合，但與國外報道存在一定的差異[12]，原因可能是不同種屬大腸埃希氏菌中的磺胺耐藥基因分布情況存在顯著差異。

5種喹諾酮類耐藥基因的平均檢出率為58.9%，該結(jié)果與石大麗[1]對豬源大腸埃希氏菌分離株的研究結(jié)果類似，原因可能是地區(qū)差異以及養(yǎng)殖場用藥習(xí)慣的不同所導(dǎo)致。

本試驗結(jié)果表明，該豬場大腸埃希氏菌耐藥情況嚴重并攜帶多種耐藥基因，應(yīng)該嚴格規(guī)范用藥，尋找替抗生物制劑，探索無抗養(yǎng)殖道路，才是未來養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展的趨勢。