管 宇，楊 慧，于 雪，郭廣君，唐 娜，魏 鳳，沈志強(qiáng)，肖躍強(qiáng)*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)，又稱為干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA激活的蛋白激酶(interferon-induced,double-stranded(ds)RNA-activated kinase)、真核翻譯起始因子2α(alpha subunit of the eukaryotic initiation factore，eIF2α)激酶2(EIF2AK2)，由EIF2AK2基因編碼，是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，能夠被細(xì)胞、病毒的雙鏈RNA(dsRNA)或合成類似物(如poly I:C)激活，在宿主抗病毒防御過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。PKR在組織細(xì)胞中呈基礎(chǔ)水平表達(dá)，并由Ⅰ型和Ⅲ型干擾素(interferon,IFN)誘導(dǎo)，正常情況下，PKR維持為非活性單體，其抗病毒活性主要通過單體PKR與病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)結(jié)合，形成二聚體并發(fā)生自身磷酸化，之后催化其底物-eIF2α磷酸化[4-5]，導(dǎo)致病毒蛋白的合成受到抑制，從而產(chǎn)生抗病毒作用。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起以母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸疾病為特征的豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)[6]，其感染的主要靶細(xì)胞是豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)[7]。作者前期開展PRRSV體外感染PAMs研究表明，PRRSV及其失活病毒粒子感染PAMs早期階段均強(qiáng)烈抑制細(xì)胞PKR本底磷酸化，以及poly(I:C)誘導(dǎo)的磷酸化[8]。因此，在早期感染階段PKR活化下調(diào)與PRRSV避免抗病毒反應(yīng)啟動復(fù)制相關(guān)。

Marc-145細(xì)胞是腎臟上皮樣細(xì)胞，從MA-104細(xì)胞克隆而來[9]，后者來源于非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)。Marc-145細(xì)胞是目前支持PRRSV體外復(fù)制增殖的重要細(xì)胞系，但細(xì)胞PKR在病毒增殖過程中發(fā)揮的作用尚不清晰，因此，本研究克隆該細(xì)胞系的PKR基因，構(gòu)建其融合表達(dá)載體，并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，為進(jìn)一步開展PRRSV與細(xì)胞抗病毒固有免疫互作機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與載體 大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、Marc-145細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、pEGFP-C1/N1載體，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol試劑、Lipo2000、SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶、RiboLock RNase Inhibitor、PageRulerTM預(yù)染蛋白Marker、GeneJET Plasmid小量制備試劑盒、GeneJET Gel Extraction試劑盒、GFP Tag mAb(GF28R)、HRP標(biāo)記Goat anti-Mouse IgG等，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL15 000與DL2 000、pMD18-T載體，TaKaRa公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、Q5超保真DNA聚合酶，NEB公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 BB150 CO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Trans-Blot?SD Cell半干轉(zhuǎn)印槽，Bio-Rad公司產(chǎn)品；ChanmpChemin凝膠成像/化學(xué)發(fā)光儀,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；Airstream?AC2型二級生物安全柜,ESCO公司產(chǎn)品；CKX41倒置熒光顯微鏡,Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 Marc-145細(xì)胞克隆自MA-104細(xì)胞，后者系源于非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)腎細(xì)胞，根據(jù)NCBI公布的非洲綠猴PKR基因序列(GenBank登錄號：EU733254)設(shè)計(jì)引物，并添加酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列見表1。

表1 PKR基因擴(kuò)增引物

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取與cDNA合成 培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，TRIzol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，DNA/RNAase Free水溶解后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，75 ℃水浴5 min，冰浴致冷，根據(jù)SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA，加入反轉(zhuǎn)錄酶buffer、dNTP、Oligo(dT)18、RiboLock RNase Inhibitor、SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶，然后50 ℃作用60 min合成cDNA，95 ℃滅活5 min。

1.2.3 蛋白激酶R基因克隆與序列分析 使用Q5超保真聚合酶擴(kuò)增PKR基因，PCR反應(yīng)體系50 μL：5×Q5超保真DNA聚合酶buffer 10 μL、10 μmol/L濃度上游與下游引物各1 μL、2.5 mmol/L濃度dNTP 2 μL、cDNA 2 μL，Q5超保真DNA聚合酶0.5 μL(1 U)，超純水補(bǔ)足；擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 120 s，共30個(gè)循環(huán)；10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測?；厥誔CR產(chǎn)物，3′端加“A”后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選、菌液PCR鑒定獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，并進(jìn)行序列分析。

1.2.4 蛋白激酶R融合EGFP表達(dá)載體構(gòu)與瞬時(shí)表達(dá) 用PKR+C1-F/R、PKR+N1-F/R引物對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，SalⅠ+BamHⅠ分別雙酶切引物PKR+C1-F/R擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pEGFP-C1，回收后進(jìn)行連接；SalⅠ+HindⅢ雙酶切引物PKR+N1-F/R擴(kuò)增產(chǎn)物，XhoⅠ+HindⅢ雙酶切載體pEGFP-N1，回收后進(jìn)行連接；將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，卡那霉素抗性篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證；將構(gòu)建正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12孔板培養(yǎng)HEK293的細(xì)胞，劑量為1 μg/孔，具體轉(zhuǎn)染方法根據(jù)Lipo 2 000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，通過熒光顯微鏡觀察、Western blot檢測EGFP標(biāo)簽蛋白表達(dá)，從而篩選能夠融合表達(dá)的重組質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 Marc-145細(xì)胞蛋白激酶R基因擴(kuò)增結(jié)果

取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果表明，在約為1.6 kb位置有1條特異性PCR產(chǎn)物，對其進(jìn)行加“A”回收，克隆至T載體，測序結(jié)果表明，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物為PKR目的基因，大小為1 653 bp，推導(dǎo)編碼550個(gè)氨基酸殘基。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與菌液PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.PKR基因；2.陰性對照；3～7.pMD18-T-PKR陽性克隆

2.2 蛋白激酶R基因編碼核苷酸序列分析

將獲得的Marc-145細(xì)胞PKR基因核苷酸序列與已公布豚鼠(Caviaporcellus)、家鼠(Musmusculus)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、野豬(Susscrofa)、人(Homosapiens)、獼猴(Macacamulatta)、川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)、綠猴(Chlorocebussabaeus)、非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)等進(jìn)行比對分析，遺傳進(jìn)化樹與序列同源性分別見圖2和圖3?？梢娦蛄型葱栽?2.2%～99.8%之間，在5種靈長類物種中，與人同源性最低，為92.5%；與其供體動物物種非洲綠猴同源性均最高，與綠猴同源性高達(dá)99.6%，與其他4種哺乳動物同源性在72.2%～77.7%之間。

圖2 PKR核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

圖3 PKR核苷酸序列同源性分析

2.3 蛋白激酶R基因編碼氨基酸序列分析

將獲得的Marc-145細(xì)胞PKR基因推導(dǎo)編碼的氨基酸序列與已公布的上述各物種進(jìn)行比對分析，遺傳進(jìn)化樹與序列同源性分別見圖4和圖5。可見序列同源性在55.4%～99.5%之間，與豚鼠及其供體物種非洲綠猴同源性分別最低、最高，與人同源性為83.5%。同時(shí)，如圖6箭頭和方框區(qū)域所示，PKR △6除豚鼠、家兔各1個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，其他6種均為LFIQME基序，PKR 296K高度保守，△6刪除或者296K突變?yōu)镽均能導(dǎo)致PKR失活[10-12]；446T與451T磷酸化是PKR激活發(fā)揮作用的重要標(biāo)記[4-5]，但靈長類動物與其他幾種哺乳動物在二者附近基序均存在遺傳差異。

圖4 PKR氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹

圖5 PKR氨基酸序列同源性分析

圖6 不同種屬PKR氨基酸序列差異性比對

2.4 蛋白R重組融合EGFP瞬時(shí)表達(dá)熒光觀察

將PCR鑒定正確的陽性克隆提取重組質(zhì)粒，測序結(jié)果證明獲得了EGFP-PKR融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pC1/N1-PKR，轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)與否，驗(yàn)證PKR能否融合表達(dá)，觀察結(jié)果見圖7。結(jié)果表明pC1-PKR轉(zhuǎn)染后觀察到綠色熒光蛋白，說明PKR成功獲得融合表達(dá)，而pN1-PKR轉(zhuǎn)染后未能觀察到熒光蛋白表達(dá)。

A.pEGFP-C1對照；B.pC1-PKR轉(zhuǎn)染；C.pN1-PKR轉(zhuǎn)染

2.5 蛋白激酶R重組融合EGFP瞬時(shí)表達(dá)的Western blot檢測

瞬時(shí)表達(dá)后收獲樣品，以GFP Tag mAb(GF28R)為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果見圖8，檢測結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致，最終表明pC1-PKR成功獲得表達(dá)，而pN1-PKR未能獲得表達(dá)，因此選擇pC1-PKR開展后續(xù)相關(guān)研究。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.細(xì)胞對照；2、3.pC1-PKR；4、5.pN1-PKR；6.pEGFP-C1

3 討論

PKR被認(rèn)為是IFN誘導(dǎo)的抗病毒作用主要的效應(yīng)因子之一，可以抑制多種病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮重要作用[13]。當(dāng)病毒侵入感染細(xì)胞，在復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生dsRNA，單體PKR與之結(jié)合后便形成二聚體，自我激活并催化自身磷酸化，磷酸化后的PKR催化其底物eIF2α的磷酸化，最終導(dǎo)致病毒蛋白合成受到抑制，從而產(chǎn)生抗病毒活性[14-15]。但有些病毒為了逃逸宿主細(xì)胞的抗病毒效應(yīng)，采取多種策略避免PKR的抗病毒活性，而這些策略的發(fā)揮一般依賴于病毒基因組非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者編碼的蛋白。非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一般與PKR直接結(jié)合，阻礙PKR自身磷酸化[16-18]；病毒編碼蛋白發(fā)揮作用機(jī)制具有多樣性[3]，或是直接結(jié)合PKR，以阻斷與dsRNA的結(jié)合，或是作為PKR的偽底物，競爭阻止eIF2α磷酸化，或是作為PKR的拮抗劑阻斷eIF2α的磷酸化，或是使PKR下游效應(yīng)分子eIF2α脫磷酸化，或是同時(shí)抑制PKR與eIF2α的磷酸化，甚至是降解PKR等。作者前期開展PRRSV體外感染PAMs研究表明，PRRSV可以強(qiáng)烈抑制PKR磷酸化，其底物eIF2α的磷酸化水平相應(yīng)受到抑制，說明PRRSV可能通過這種途徑達(dá)到促進(jìn)自身增殖的目的。PAMs是PRRSV感染的天然宿主細(xì)胞，但Marc-145細(xì)胞是病毒體外增殖依賴的重要傳代細(xì)胞系，由于細(xì)胞動物來源、原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞差異等，PRRSV在Marc-145細(xì)胞復(fù)制增殖時(shí)PKR所起的作用尚不得而知，對其開展相關(guān)研究非常必要。

因此，本研究克隆了Macr-145細(xì)胞PKR基因，進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，由于該細(xì)胞系來源于MA-104細(xì)胞，而后者來源于非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)，因此，與非洲綠猴PKR基因同源性最高，核苷酸、氨基酸同源性分別為99.8%和99.5%，氨基酸殘基發(fā)生I23V、S178P、I409L共3個(gè)位點(diǎn)突變；與綠猴(Chlorocebussabaeus)核苷酸、氨基酸同源性分別高達(dá)99.6%和98.9%，與獼猴、川金絲猴同源性較高，但依次降低，與人核苷酸、氨基酸同源性進(jìn)一步降低至92.5%和83.5%，與其他4種哺乳動物同源性較低，尤其是野豬，僅分別為76.1%和60.1%。PRRSV既可以在Marc-145細(xì)胞增殖，也可以在豬體內(nèi)細(xì)胞如PAMs、單核細(xì)胞等增殖，而二者PKR序列差異較大，因此，推測PKR在病毒復(fù)制增殖過程發(fā)所發(fā)揮的作用不盡相同，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。通過分析發(fā)現(xiàn)，PKR △6 LFIQME基序、PKR 296K以及446T與451T磷酸化位點(diǎn)均高度保守，這些保證了PKR作為抗重要病毒因子的特性。同時(shí)，通過氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)與所參考物種相比，271K是Marc-145細(xì)胞與其供體物種非洲綠猴所特有的，其他物種除了豚鼠是V，均為E，這一氨基酸位點(diǎn)對于其功能是否產(chǎn)生影響？與PRRSV感染或者復(fù)制是否有關(guān)聯(lián)？需要開展相關(guān)研究闡明。

綜上所述，本研究成功克隆了Marc-145細(xì)胞PKR基因，對其遺傳進(jìn)化及同源性進(jìn)行了分析與比較，并進(jìn)行了融合表達(dá)，為進(jìn)一步開展其與PRRSV互作機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。