石 娟 包鴻慧 張 佩 張倜培 周 睿

(湖北文理學(xué)院食品科技學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053)

蕓豆又名四季豆和菜豆，全球種植面積僅次于大豆，尤其在亞洲國(guó)家被廣泛應(yīng)用于焙烤產(chǎn)品、豆餡、沙拉及罐頭等傳統(tǒng)食品中[1]。蕓豆富含膳食纖維、淀粉、蛋白質(zhì)、植物化學(xué)物質(zhì)及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)組分[2]。與馬鈴薯淀粉和谷類淀粉相比，蕓豆淀粉(C-型)具有較高的直鏈淀粉含量、更加牢固的直鏈淀粉間交互作用及較低的淀粉消化率[3]。蕓豆蛋白無(wú)麩質(zhì)，富含賴氨酸且消化率高，是人類膳食蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，具有降膽固醇、癌癥預(yù)防及2型糖尿病防治等多重健康益處[4]。此外，酚酸、類黃酮(兒茶素和原花青素等)和縮合單寧是蕓豆籽粒主要的酚類化合物，具有良好的抗氧化、降血糖、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤及抗衰老等功效[5]。

目前，有關(guān)蕓豆的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)組分[5]，功能活性[1,6-7]，加工工藝對(duì)物化特性、活性組分及功能活性的影響[3,8-10]等方面。蕓豆各營(yíng)養(yǎng)組分只有經(jīng)人體胃腸道消化吸收并參與新陳代謝，才能有效發(fā)揮其最大功效。體外模擬消化是通過(guò)體外構(gòu)建與體內(nèi)消化環(huán)境相近的消化模型，模仿口腔、胃和腸道階段對(duì)食物的消化分解歷程，已被廣泛應(yīng)用于食物中活性組分的生物可及性和生物可利用性評(píng)估[10-14]，但蕓豆體外胃腸模擬消化的研究?jī)H局限于蕓豆α-淀粉酶抑制劑[10]、蕓豆蛋白[13]及蕓豆淀粉[14]的體外消化特性研究，而有關(guān)煮制蕓豆體外胃腸模擬消化液的生物活性及其淀粉消化動(dòng)力學(xué)與葡萄糖擴(kuò)散性能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬選用3種花色蕓豆(白、紅和黑色)為原料，通過(guò)體外胃腸模擬消化模型，分析煮制蕓豆消化液總酚、總黃酮和酸性多糖含量、抗氧化活性與α-淀粉酶抑制活性，以及消化過(guò)程中淀粉水解動(dòng)力學(xué)與葡萄糖擴(kuò)散性能，并探究消化液活性組分含量與體外生物活性及淀粉水解特征參數(shù)的相關(guān)性，旨在合理認(rèn)知與評(píng)價(jià)全蕓豆食品的生理功效，為不同花色蕓豆資源的功能性開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黑蕓豆：產(chǎn)地為黑龍江省哈爾濱市，長(zhǎng)度為(9.82±0.79) mm，寬度(5.76±0.56) mm，單粒重(0.20±0.03) g(n=50)，市售；

紅蕓豆：產(chǎn)地為山西省大同市，長(zhǎng)度為(16.12±1.33) mm，寬度(7.28±0.78) mm，單粒重(0.54±0.10) g(n=50)，市售；

白蕓豆：產(chǎn)地為湖北省恩施州利川市，長(zhǎng)度為(25.24±2.08) mm，寬度(16.34±1.35) mm，單粒重(1.82±0.36) g(n=50)，市售；

α-淀粉酶(A3176)、胃蛋白酶(P7000)、膽汁鹽(48305)、胰酶(P7545)、α-葡萄糖苷酶(G5003)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、4-硝基酚-α-D-呋喃葡萄糖苷(pNPG)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：上海阿拉丁有限公司；

L-抗壞血酸(VC)、蘆丁、沒(méi)食子酸、β-D-半乳糖醛酸：上海源葉生物科技有限公司；

D-葡萄糖測(cè)定試劑盒：愛(ài)爾蘭Megazyme公司；

其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機(jī)：BO-1000S1型，永康市鉑歐五金制品有限公司；

電子分析天平：FA1004N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

高速離心機(jī)：LC-LX-L6OD型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

恒溫振蕩水浴鍋：SHA-B型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：LDO-9070A型，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：L5S型，上海精密儀器儀表有限公司；

純水機(jī)：Milli-Q 型，美國(guó)Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 精選籽粒飽滿、質(zhì)地均勻、無(wú)蟲蝕劣變的干凈蕓豆，粉碎，過(guò)60目篩，密封避光冷藏(-20 ℃)備用。其中，白蕓豆粉、紅蕓豆粉及黑蕓豆粉淀粉含量分別為(46.84±0.31)%，(49.44±0.55)%，(48.49±0.82)%；水分含量分別為(10.31±0.26)%，(9.35±0.21)%，(9.82±0.18)%；蛋白質(zhì)含量分別為(22.27±0.52)%，(24.00±0.37)%，(23.52±0.49)%；脂肪含量分別為(1.86±0.04)%，(1.61±0.06)%，(2.11±0.08)%；灰分含量分別為(4.01±0.07)%，(4.55±0.15)%，(4.16±0.11)%。

1.2.2 體外模擬消化 參照Minekus等[11]的方法并修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g豆粉，加入裝有5 mL蒸餾水的消化試管中。室溫磁力攪拌10 min，旋蓋封口，95 ℃水浴20 min，37 ℃恒溫水浴鍋冷卻得豆粉糊液。

(1) 體外模擬口腔消化階段(SSF)：向豆粉糊液中加入3.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)以及3粒玻璃珠，震蕩1 min，依次添加0.5 mLα-淀粉酶液(1 gα-淀粉酶懸浮于10 mL蒸餾水中，3 500 r/min離心10 min)和150 μL CaCl2溶液(50 mmol/L)，混勻，100 r/min、37 ℃水浴5 min。

(2) 模擬胃液消化階段(SGF)：向模擬口腔消化液中加入5 mL蒸餾水，并用1 mol/L HCl溶液迅速調(diào)節(jié)體系pH至3.0，添加1 mL胃蛋白酶液(1%)和30 μL CaCl2溶液，100 r/min、37 ℃水浴2 h。

(3) 模擬腸道消化階段(SIF)：用1 mol/L NaOH溶液迅速調(diào)節(jié)模擬胃消化體系pH至7.0，依次加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液、5 mL胰酶和膽汁鹽混合溶液(胰酶20 mg/mL，膽汁鹽50 mg/mL)和240 μL CaCl2溶液，100 r/min、37 ℃水浴2 h。消化結(jié)束后，將消化管于沸水浴中煮制5 min，冷卻至室溫。5 000 r/min離心10 min并收集上清液，用蒸餾水定容，用于活性組分含量、抗氧化及α-淀粉酶抑制活性測(cè)定。同時(shí)，將模擬消化液直接轉(zhuǎn)入透析袋中進(jìn)行模擬葡萄糖吸收特性評(píng)價(jià)。

1.2.3 活性組分測(cè)定

(1) 總酚含量：福林酚比色法。

(2) 總黃酮含量：三氯化鋁比色法。

(3) 酸性多糖含量：硫酸咔唑比色法[15]。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定

(1) DPPH自由基清除活性：參照Brand-Williams等[16]的方法。

(2) ABTS+自由基清除活性：參照Re等[17]的方法。

(3) 鐵離子還原抗氧化能力(FRAP)：參照Benzie等[18]的方法。

1.2.5α-淀粉酶抑制活性測(cè)定 參照Tan等[19]的方法并略作修改。采用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.9)配制小麥淀粉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，并煮沸15 min。α-淀粉酶溶液(1 U/mL)用含有6.7 mmol/L NaCl的磷酸緩沖液配制。加入20 mL 3,5-二硝基水楊酸(96 mmol/L)和8 mL 酒石酸鉀鈉(5.31 mol/L，2 mol/L NaOH配置)，混勻，加入12 mL去離子水稀釋制備DNS溶液。將500 μLα-淀粉酶與500 μL樣品混勻，37 ℃孵育10 min。加入500 μL淀粉溶液，孵育10 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴滅酶5 min，冷卻，加入10 mL去離子水，混勻，測(cè)定540 nm處吸光度，并按式(1)計(jì)算α-淀粉酶活性抑制率。

ω=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%，

(1)

式中：

ω——α-淀粉酶活性抑制率，%；

A1——非抑制組，即磷酸緩沖液、淀粉液、酶液及DNS試劑混合體系的吸光值；

A2——空白對(duì)照組，即磷酸緩沖液、淀粉液及 DNS試劑混合體系的吸光值；

A3——抑制組，即樣品、淀粉液、酶液及DNS試劑混合體系的吸光值；

A4——背景對(duì)照組，即樣品、淀粉液及DNS試劑混合體系的吸光值。

1.2.6 蕓豆淀粉消化性能測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[20]的方法并略作修改。從模擬口腔消化結(jié)束階段、模擬胃消化結(jié)束階段以及模擬腸消化階段(0，10，20，30，60，90，120 min)分別等量量取0.1 mL消化液轉(zhuǎn)移至裝有0.9 mL 95%乙醇的微量離心管中，旋蓋渦流震蕩混勻，終止酶反應(yīng)，12 000 r/min離心5 min取上清液，采用GOPOD試劑盒法測(cè)定消化液中釋放的葡萄糖含量。并分別按式(2)～式(5)計(jì)算淀粉水解率(HI)以及快速消化淀粉(RDS)、緩慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量。

HI=[(At-A)×0.9]/W×100%，

(2)

RDS=[(A20-A)×0.9]/W×100%，

(3)

SDS=[(A120-A20)×0.9]/W×100%，

(4)

RS=[1-(A120-A)×0.9/W]×100%，

(5)

式中：

At——體外模擬消化過(guò)程中t時(shí)刻釋放的葡萄糖量，mg；

A20、A120——模擬腸消化20，120 min后釋放的葡萄糖量，mg；

A——消化前混合體系所含的游離葡萄糖量，mg；

W——淀粉總質(zhì)量，mg。

C=C∞[1-exp(-Kt)]，

(6)

式中：

C——水解過(guò)程中t時(shí)刻的淀粉水解率，%；

C∞——淀粉水解的平衡濃度，%；

K——一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，min-1。

1.2.7 消化液葡萄糖擴(kuò)散性能測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[20]的方法并略作修改。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入透析袋(分子量截留值3 500 Da)中，置于裝有450 mL磷酸緩沖液(pH 6.8)的燒杯中，37 ℃恒溫水浴，分別于0，10，20，30，60，90，120，150，180 min量取0.1 mL等份樣品，采用GOPOD試劑盒測(cè)定透析液中葡萄糖濃度。每次等量取出樣品后，再等量補(bǔ)充0.1 mL磷酸緩沖液于燒杯中，并按式(7)計(jì)算消化液葡萄糖擴(kuò)散速率。

V=Gt/t，

(7)

式中：

V——葡萄糖擴(kuò)散速率，μg/min；

Gt——透析過(guò)程中t時(shí)刻透析液中的葡萄糖量，μg；

t——透析時(shí)間，min。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Excel 2019軟件進(jìn)行基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較及相關(guān)性分析；采用ANOVA算法進(jìn)行單因素方差分析；采用Origin 9.0軟件進(jìn)行圖表繪制。顯著性水平選定P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓豆消化液的活性組分含量

由表1可知，3種蕓豆消化液總酚含量為14.80～17.47 mg GAE/g，高于王何柱等[22]的研究結(jié)果；總黃酮含量為3.63～6.32 mg RE/g以及酸性多糖含量為34.00～39.38 mg AGE/g，其中黑蕓豆消化液的總酚、總黃酮及酸性多糖含量最高，白蕓豆的最低。Kan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，26種蕓豆總黃酮含量為0.19～7.05 mg RE/g，與試驗(yàn)測(cè)定值略有差異，且其對(duì)原料生豆粉中水溶性膳食纖維的半乳糖醛酸的測(cè)定值(0.15%～0.60%)遠(yuǎn)低于試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。此外，梁亞靜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黑蕓豆總酚含量為7.3 mg GAE/g，總黃酮含量為2.4 mg RE/g，低于試驗(yàn)煮制黑蕓豆消化液的測(cè)定值(17.47 mg GAE/g和6.32 mg RE/g)，這可歸因于體外胃腸模擬消化體系有利于蕓豆粉中酚類物質(zhì)及多糖等活性組分的釋放[25]。

2.2 蕓豆消化液的抗氧化活性

由表2可知，3種蕓豆消化液對(duì)DPPH自由基與ABTS+自由基清除能力及鐵離子還原抗氧化能力分別為6.74～8.75，45.74～49.75，4.39～19.82 mg AAE/g。黑蕓豆和紅蕓豆消化液的抗氧化能力明顯強(qiáng)于白蕓豆，且存在顯著性差異(P<0.05)，與王何柱等[22]的結(jié)論保持一致，可能是由不同花色蕓豆消化液中的多酚、黃酮類及酸性多糖等抗氧化活性物質(zhì)含量差異所致。

表1 蕓豆消化液總酚、總黃酮及酸性多糖的含量?

2.3 蕓豆消化液對(duì)α-淀粉酶的抑制活性

由表2可知，3種蕓豆消化液對(duì)α-淀粉酶具有一定的抑制能力，活性抑制率為20.99%～31.22%，黑蕓豆消化液抑制能力最強(qiáng)，紅蕓豆次之，白蕓豆最弱，且樣品間抑制率差異顯著(P<0.05)，可歸因于蕓豆籽粒中富含α-淀粉酶抑制劑[26]，但體外模擬胃消化環(huán)境易引起α-淀粉酶抑制劑活性組分的破壞損失，導(dǎo)致其α-淀粉酶抑制活性有所降低[10]。

表2 蕓豆消化液的抗氧化活性與α-淀粉酶抑制活性?

2.4 蕓豆淀粉體外消化動(dòng)力學(xué)

由圖1可知，在0～5 min模擬口腔消化階段(SSF)與125～245 min模擬腸消化階段(SIF)，由于淀粉酶的存在，促使淀粉水解速率加快；而在5～125 min模擬胃消化階段(SGF)，由于淀粉酶的缺失與低pH環(huán)境，導(dǎo)致淀粉水解速率變緩。SSF消化階段，白蕓豆、紅蕓豆及黑蕓豆的淀粉消化水解率分別為5.75%，4.34%，3.79%；SIF消化結(jié)束時(shí)，3種蕓豆淀粉水解率分別提升至52.73%，49.11%，47.28%。模擬腸消化階段(SIF)前20 min內(nèi)，3種蕓豆淀粉消化速率快速增加，隨后淀粉消化曲線趨于平緩。與白蕓豆相比，紅蕓豆與黑蕓豆淀粉水解率在SIF階段20 min時(shí)分別下降了15.46%，19.37%，在SIF消化階段120 min時(shí)分別下降了6.87%，10.34%。

圖1 蕓豆淀粉體外模擬消化Figure 1 In vitro simulated digestion of kidney bean starch

由表3可知，3種蕓豆淀粉消化過(guò)程曲線擬合性較好(R2>0.96)，蕓豆淀粉的水解動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)K為0.061～0.081 min-1，其中紅蕓豆與黑蕓豆的K值較小，白蕓豆的較大，表明紅蕓豆與黑蕓豆淀粉的消化速率明顯低于白蕓豆。王苗苗等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蕓豆籽粒細(xì)胞淀粉消化速率K為0.000 1 min-1，消化程度為4.21%，遠(yuǎn)低于試驗(yàn)結(jié)果，主要是由于其采用豬胰酶體外酶解生蕓豆試驗(yàn)體系與試驗(yàn)選用的煮制蕓豆體外胃腸模擬消化模型存在顯著差異所致。白蕓豆中快速消化淀粉含量(RDS)較高為42.05%，緩慢消化淀粉含量(SDS，10.67%)與抗性淀粉(RS，47.28%)含量相對(duì)較低，而紅蕓豆與黑蕓豆RDS含量相對(duì)較低(35.55%和33.91%)，SDS與RS含量相對(duì)較高(13.55%和13.37%，50.90%和52.72%)。馬夢(mèng)婷等[27]研究發(fā)現(xiàn)，10種蒸煮雜豆粉的RDS含量為61.2%～70.6%，明顯高于試驗(yàn)結(jié)果，可能是由于原料品種來(lái)源及選用的體外淀粉消化方式不同所致。

表3 蕓豆淀粉體外模擬消化特征參數(shù)?

2.5 蕓豆消化液中葡萄糖擴(kuò)散特性

由圖2可知，透析液中葡萄糖濃度呈先快速上升后增加變緩的趨勢(shì)，而葡萄糖擴(kuò)散速率呈先快速降低后趨于平緩的趨勢(shì)。透析0～20 min，3種蕓豆消化液中葡萄糖擴(kuò)散能力較強(qiáng)，但透析20～180 min，葡萄糖擴(kuò)散速率明顯減慢。當(dāng)透析時(shí)間為10 min時(shí)，白蕓豆、紅蕓豆和黑蕓豆透析液中葡萄糖質(zhì)量濃度分別為78.60，71.07，68.54 mg/L，相應(yīng)的葡萄糖擴(kuò)散速率分別為3 536.80，3 198.07，3 084.52 μg/min。透析結(jié)束時(shí)，3種蕓豆透析液中擴(kuò)散葡萄糖最終質(zhì)量濃度分別提高至113.48，105.55，101.77 mg/L，但相應(yīng)的葡萄糖擴(kuò)散速率(283.69，263.88，254.42 μg/min)卻快速降低了91%以上。與白蕓豆相比，透析180 min時(shí)，紅蕓豆與黑蕓豆透析液葡萄糖濃度分別下降了6.99%，10.32%，表明紅蕓豆與黑蕓豆消化液中的葡萄糖擴(kuò)散能力明顯弱于白蕓豆。這可能與消化液體系中活性物質(zhì)的組成及含量差異性有關(guān)。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，具有增強(qiáng)體系黏稠特性的水溶性膳食纖維(多糖)有助于延緩消化釋放葡萄糖的擴(kuò)散性與吸收性。

圖2 蕓豆消化液中葡萄糖的擴(kuò)散能力Figure 2 Glucose diffusion ability of kidney bean digestive solution

2.6 相關(guān)性分析

由表4可知，蕓豆消化液活性組分總酚、總黃酮及酸性多糖含量與3種抗氧化活性均呈顯著正相關(guān)性(r>0.99，P<0.05)，表明蕓豆經(jīng)體外胃腸模擬消化后釋放的總酚、總黃酮及酸性多糖等活性組分對(duì)消化液表現(xiàn)出的抗氧化活性起到重要作用，與梁亞靜等[24]的結(jié)論一致。蕓豆消化液活性組分與葡萄糖擴(kuò)散速率V180呈顯著負(fù)相關(guān)性(r>0.99，P<0.05)，表明蕓豆相關(guān)活性組分對(duì)消化液中的葡萄糖擴(kuò)散起到了一定的抑制作用，可能歸因于：① 蕓豆模擬消化期間酚類物質(zhì)不斷釋放，一定程度上減弱了淀粉酶的消化降解，導(dǎo)致豆粉顆粒細(xì)胞破裂崩解程度變緩，消化殘?jiān)w粒的阻礙作用延遲了葡萄糖的擴(kuò)散；② 消化體系釋放的水溶性多糖大分子有助于消化液黏稠度的增強(qiáng)，從而抑制葡萄糖的擴(kuò)散[20,28]；③ 可溶性膳食纖維表面吸附的帶正電荷花色苷可通過(guò)與葡萄糖分子活性羥基相結(jié)合，促進(jìn)葡萄糖的吸附及葡萄糖擴(kuò)散的抑制[29]。蕓豆消化液活性組分與α-淀粉酶抑制率及淀粉水解速率常數(shù)(K)的相關(guān)性不顯著，但Pearson相關(guān)系數(shù)r高達(dá)0.88以上，可能是由于蕓豆消化體系中其他組分(可溶性蛋白、多肽等)及組分間的協(xié)同效應(yīng)(多酚—蛋白及多酚—多糖等)對(duì)α-淀粉酶抑制活性和淀粉消化吸收性產(chǎn)生了重要影響[9,30]。因此，顏色較深蕓豆品種有利于胃腸模擬消化體系的抗氧化活性和α-淀粉酶抑制活性的增強(qiáng)，以及淀粉消化速率與釋放葡萄糖擴(kuò)散速率的減弱，具有潛在的健康促進(jìn)功效。

表4 蕓豆消化液活性組分與體外抗氧化和α-淀粉酶抑制活性及淀粉消化特征參數(shù)的相關(guān)性?

3 結(jié)論

利用體外胃腸模擬消化模型研究了3種蕓豆消化液的總酚、總黃酮和酸性多糖含量、抗氧化活性及α-淀粉酶的抑制活性，并考察了淀粉體外酶解動(dòng)力學(xué)與葡萄糖擴(kuò)散性能。結(jié)果表明，3種蕓豆消化液均具有良好的抗氧化活性和一定的α-淀粉酶抑制活性。黑蕓豆消化液總酚、總黃酮和酸性多糖含量、α-淀粉酶抑制活性以及緩慢消化淀粉和抗性淀粉含量最高，而淀粉水解率、一級(jí)動(dòng)力學(xué)淀粉水解速率、平衡濃度、快速消化淀粉含量以及消化液葡萄糖擴(kuò)散量和擴(kuò)散速率均最低。Pearson相關(guān)性分析表明，蕓豆消化液活性組分含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，與葡萄糖擴(kuò)散速率呈顯著負(fù)相關(guān)。后續(xù)可進(jìn)一步研究蕓豆體外和體內(nèi)消化過(guò)程中可溶性膳食纖維(多糖)—多酚、多酚—蛋白(多肽)等協(xié)同交互效應(yīng)對(duì)蕓豆消化活性物質(zhì)的釋放、生物利用率及其生物活性的影響機(jī)制。