徐秀娟 王愛霞 胡少東 史清照 楊春強 馬 驥

(1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001；2. 河南中煙工業(yè)有限責任公司黃金葉生產制造中心，河南 鄭州 450000；3. 河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，河南 鄭州 450000)

Maillard反應是氨基化合物與還原糖之間發(fā)生的復雜反應，是煙草眾多香味物質的主要來源之一，對煙草的品質起著重要作用。煙葉自身含有葡萄糖、果糖等還原糖，同時還有脯氨酸、谷氨酸等多種氨基酸，具備美拉德反應的物質基礎，與模型反應相比，基于煙葉或煙草提取物的美拉德反應香料與卷煙的協(xié)調性更好，能夠很好地改善卷煙產品的感官品質，是煙草行業(yè)研究熱點之一[1]。煙葉與甘氨酸在堿性條件下的反應產物，與煙香協(xié)調性好，能豐富煙香，細柔煙氣，改善透發(fā)性[2]；廢棄煙葉經酶處理后制備的煙用香精具有沁鼻的烘烤香和甜香，能改善煙草吸食品質[3-4]；烤煙花蕾也可用于制備Maillard反應香料[5]。目前這些報道多是直接將煙草原料用于Maillard反應香料的制備，然而在卷煙中起作用的不僅是Maillard反應產物，還有煙草自身香味物質的參與，Maillard反應產物對卷煙的貢獻不夠清晰。此外，雪茄煙葉與烤煙的還原糖、氨基酸差異較大，雪茄煙葉或殘渣參與的Maillard反應未被充分挖掘[6]。

研究擬以經過亞臨界萃取、溶劑浸提后的雪茄煙葉殘渣制備的水提物為底物，開展Maillard反應香料制備工藝優(yōu)化，系統(tǒng)考察氨基酸和還原糖的種類及用量、反應時間等重要工藝參數(shù)對反應產物感官質量及18種特征香味成分含量的影響，通過相關性分析探討香味成分與卷煙感官指標的相關性關系，旨在為煙葉殘渣的二次利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

氣相色譜—質譜聯(lián)用儀：7890A/5975C型，美國Agilent公司；

電子天平：CP224S型，感量0.000 1 g，德國Sartorius公司；

合成反應器：Easymax 102型，瑞士Mettler Toledo公司；

旋轉蒸發(fā)儀：R-210型，瑞士Buchi公司；

低溫冷卻循環(huán)泵：DLSB-5/20型，鞏義市予華儀器有限公司；

多功能油浴鍋：HH-ZKYY型，鞏義市予華儀器有限公司；

低溫冰箱：PL6500型，美國Thermo Fisher公司；

中藥粉碎機：FW-200型，浙江永康帥通工具有限公司；

凍干機：ALPHA 1-2LD plus型，德國Christ公司；

尼龍66濾膜：0.22 μm，中國天津津騰公司；

L-谷氨酸、L-天冬氨酸、脯氨酸：分析純，阿拉丁試劑(中國)有限責任公司；

蒸餾水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司；

雪茄煙葉(建恒4號)、紅旗渠(雪茄)、白色未加香卷煙紙：河南中煙工業(yè)有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 煙草水提物的制備 將雪茄煙葉粉碎后，采用亞臨界萃取法進行一級萃取[溶劑為二甲醚，夾帶劑95%乙醇，V二甲醚∶V乙醇=10∶1，m煙葉∶V二甲醚=1∶20 (g/mL)，萃取時間20 min，萃取3次]；以60%乙醇為溶劑，加熱至回流進行二級萃取[m煙葉∶V60%乙醇=1∶10 (g/mL)，萃取時間3.0 h]，萃取后的煙葉殘渣作為煙草水提物的原料。

通過水提法制備煙草水提物，采用單因素試驗，以總氮含量和產率為指標，優(yōu)化料液比、提取時間和提取溫度。固定提取時間3.0 h，提取溫度60 ℃，考察料液比[m煙葉殘渣∶V水分別為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14 (g/mL)]對水提物中總氮含量和產率的影響；固定料液比(m煙葉殘渣∶V水)1∶12 (g/mL)，提取溫度60 ℃，考察提取時間(0.5，1.0，2.0，3.0，3.5 h)對水提物中總氮含量和產率的影響；固定料液比(m煙葉殘渣∶V水)1∶12 (g/mL)，提取時間3.0 h，考察提取溫度(40，60，80，90，100 ℃)對總氮含量和產率的影響。采用YC/T 161—2002測定水提物中總氮含量，采用YC/T 282—2009測定氨基酸含量。水提物產率和總氮產率分別按式(1)和式(2)計算。

(1)

式中：

w1——水提物產率，%；

m1——水提物中干物質含量，g；

m2——煙葉質量，g。

(2)

式中：

w2——總氮產率，%；

m3——水提物中總氮含量，g；

m2——煙葉質量，g。

最優(yōu)工藝條件下制備的煙草水提取物用于Maillard反應，其折光指數(shù)(20 ℃)為1.355 6±0.008 0，相對密度(20 ℃)為1.078 1±0.008 0。

1.2.2 美拉德反應香料的制備 稱取10.00 g煙草水提物及一定量的氨基酸、還原糖，轉移至玻璃反應管中，攪拌速度為800 r/min，加熱至110 ℃，并保持3.0 h。反應結束后冷卻至室溫，抽濾，收集濾液即可。對照試驗中將煙草水提物替換為水，其他反應條件不變，試驗參數(shù)詳見表1。

采用單因素試驗，對氨基酸與還原糖的摩爾比、反應時間進行優(yōu)化。固定反應時間3.0 h，反應溫度110 ℃，考察氨基酸與葡萄糖摩爾比(2∶1，1∶1，2∶3，1∶2，2∶5對應的反應產物編號分別為M-7、M-8、M-9、M-4、M-10)對美拉德反應香料感官質量的影響；固定反應溫度110 ℃，氨基酸與葡萄糖摩爾比2∶1，考察反應時間(0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，3.5 h對應的反應產物編號分別為M-11、M-12、M-13、M-14、M-7、M-15)對美拉德反應香料感官質量的影響。

表1 氨基酸、還原糖種類及用量

1.2.3 感官評價 挑選質量為(0.815±0.070) g、吸阻為(1 100±200) Pa的空白卷煙樣品，將美拉德反應香料及煙草水提物稀釋至質量百分濃度為10%(溶劑為水)，分別涂布于卷煙紙上，涂布量為0.3%(濕重)。涂布完畢后，將卷煙裝入煙盒中，密封于(22±2) ℃和相對濕度(RH) (60±5)%的條件下放置1周。感官評價方法參照文獻[7]。請7位已取得卷煙感官評吸資格證書的專業(yè)人員進行評價，評價結果采用算術平均值統(tǒng)計分析。

1.2.4 美拉德反應香料的成分分析

(1) 定性分析：稱量0.50 g樣品，加入乙酸苯乙酯(0.80 mg/mL，5 μL)作為內標，并加入二氯甲烷，室溫震蕩50 min，有機相干燥、過濾后進行GC-MS分析，分析條件：色譜柱為DB-WAXetr毛細管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣；載氣流量1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比10∶1；程序升溫以3 ℃/min的升溫速率從50 ℃加熱到250 ℃，并保持10 min。電離方式為EI；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；電子倍增器電壓1.89 kV；質量掃描范圍33～500 amu；掃描方式全掃描；溶劑延遲10.0 min。

參考各化合物的保留時間，對每個色譜峰進行譜庫(NIST08和WILEY)檢索，確定美拉德反應香料的各化學成分；采用內標法進行定量。

(2) 定量分析： 分別稱量0.50 g樣品，加入5 mL含內標(丙酸蘇合香酯10.296 μg/mL)的二氯甲烷萃取劑，室溫振蕩50 min，萃取液干燥過濾后待用。根據(jù)文獻[8]對美拉德反應香料進行定量分析。

1.2.5 相關性分析 采用SPSS 18.0軟件對Maillard反應產物和卷煙感官指標進行簡單相關分析，P<0.05為顯著相關，P<0.01為極顯著相關。

2 結果與討論

2.1 煙草水提物的制備

2.1.1 料液比對總氮提取效率的影響 試驗所用煙葉已經過亞臨界萃取、溶劑浸提(60%乙醇)兩步提取工藝，煙葉中的大部分香味物質已被萃取，雪茄煙葉殘渣水提物以糖類、氨基酸等大分子物質為主。由于雪茄煙葉含糖量低，含氮量略高，因此在優(yōu)化煙草水提物提取工藝時，以總氮含量和產率為主要依據(jù)。由圖1(a)可知，隨著料液比的增大，總氮含量先升高后降低，當m煙葉殘渣∶V水為1∶8 (g/mL)時，總氮含量最低為7.48 mg/g，當m煙葉殘渣∶V水為1∶12 (g/mL)時，總氮含量增加到11.14 mg/g，而m煙葉殘渣∶V水為1∶14 (g/mL)時，總氮含量略微降低至10.74 mg/g。水提物產率隨著料液比的增加而升高，當m煙葉殘渣∶V水為1∶12 (g/mL)時總氮含量達到最高，同時總氮產率達到1.54%；當m煙葉殘渣∶V水為1∶14 (g/mL)時，雖然水提物產率增高到14.67%，但總氮含量略有降低，總氮產率變化不大。這是因為，溶劑含量的增高會使得更多難揮發(fā)成分被萃取出來，但總氮的萃取已達到飽和狀態(tài)，因此雖然水提物產率增高，但總氮含量降低，因此m煙葉殘渣∶V水選擇1∶12 (g/mL)。

圖1 反應條件對總氮含量、產率及水提物產率的影響Figure 1 The effect of reaction conditions on nitrogen content, extraction rate and water extraction yield

2.1.2 提取時間對總氮提取效率的影響 隨后在m煙葉殘渣∶V水為1∶12 (g/mL)，提取溫度60 ℃的條件下，考察提取時間對總氮含量和產率的影響。由圖1(b)可知，總氮含量隨著提取時間的延長先增加后降低，當提取時間為0.5，1.0 h時，總氮含量變化不大，分別為3.77，3.63 mg/g；當提取時間延長至2.0 h時，總氮含量大幅上升，增加至7.63 mg/g，是1.0 h時的2.1倍；萃取時間為3.0 h時，總氮含量達到最高值，為8.50 mg/g；而萃取時間過長，總氮含量降低(6.35 mg/g)。水提物產率整體呈上升趨勢，總氮產率先增加后降低，當萃取時間為2.0 h時，產率為1.85%，延長至3.0 h時為1.86%，表明總氮產率已趨于平衡，因而最佳萃取時間選擇3.0 h。

2.1.3 提取溫度對總氮提取效率的影響 在確定料液比和提取時間之后，進一步對提取溫度進行優(yōu)化。由圖1(c) 可知，整體而言，隨著提取溫度的升高，水提物產率呈上升趨勢，總氮含量呈下降趨勢。當提取溫度為40～80 ℃時，總氮含量為24.92～25.89 mg/g，變化不大；當溫度升高至90 ℃時，總氮含量降低至24.06 mg/g，且隨著溫度的提高繼續(xù)降低至21.37 mg/g?？偟a率先增加后降低，從1.96%增加至2.91%，隨后又降低至2.61%。當溫度為80 ℃時，總氮含量及產率皆達到最高值，因而，最佳提取溫度確定為80 ℃。

最終，通過單一因素試驗確定雪茄煙葉殘渣水提物的最佳工藝條件為：m煙葉殘渣∶V水為1∶12 (g/mL)，加熱溫度80 ℃，萃取時間3.0 h。水提物產率為11.25%，總氮含量為25.89 mg/g，總氮產率為2.91%。

2.2 美拉德反應香料的制備及感官評價

2.2.1 氨基酸和還原糖種類對美拉德反應香料感官質量的影響 美拉德反應過程復雜，反應產物與反應條件關系密切，而氨基酸和還原糖是影響美拉德產物組成及香氣的關鍵因素，因而氨基酸和還原糖的選取至關重要。為了使美拉德反應產物的香氣更接近煙草香，與卷煙協(xié)調性好，在選取氨基酸和還原糖時本著煙葉中自身含有且含量較高的原則。雪茄煙葉中含量較高的氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸，還原糖為葡萄糖、果糖，因而將此作為反應原料[9]。雖然經單一因素優(yōu)化后，雪茄煙葉的總氮被完全萃取，但水提物的總氮含量仍較低。利用氨基酸分析儀對水提物中的氨基酸含量進行分析，氨基酸總量為261.29 μg/g，其中天冬氨酸和谷氨酸含量分別為78.60，11.80 μg/g。為提高反應效率，以水提物為底物，額外補加氨基酸和還原糖，制備美拉德反應香料。

首先，對氨基酸和還原糖的種類進行篩選，試驗條件如表1所示，各組反應物的感官評價結果如表2所示。首先，將煙草水提物直接涂布于卷煙紙上進行對比評價，與空白卷煙相比，水提物在品質特征方面幾乎無作用，在風格特征方面，僅干草香、焦香略有改善，表明雪茄煙葉殘渣水提物對卷煙感官質量的提升幾乎無作用。而6種Maillard反應物M1～M6在香氣、豐濃、雜氣、刺激、細柔等方面均有改善，在風格特征方面，干草香、焦香、烘焙香、蜜甜香等有不同程度的改善。這表明，與煙草水提物相比，美拉德反應產物能夠起到增加香氣、豐富煙氣濃度和特征香韻等作用。

對比M-2和M-4，兩組的還原糖(葡萄糖)、反應底物(水提物)一致，僅氨基酸種類不同，從表2可以看出，M-4(天冬氨酸+谷氨酸)的香氣、豐濃、甜味、綜合味覺等品質特征，以及焦香、蜜甜香、果香等風格特征均明顯優(yōu)于M-2(天冬氨酸)，表明以混合氨基酸為氮源的美拉德反應香料感官效果優(yōu)于單一氨基酸，因此選擇天冬氨酸和谷氨酸混合使用。與M-4(葡萄糖)相比，M-5(果糖)的品質特征、味覺特征、風格特征均有所削弱，說明使用葡萄糖的效果優(yōu)于果糖。這可能與反應活性及反應產物種類有關。由于五碳糖的反應活性高于六碳糖，因此葡萄糖的反應活性高于果糖；兩者反應產物的種類也有差異，以果糖為原料的美拉德反應產物中吡嗪類香味成分的質量分數(shù)較高[10]。此外，對比M-4和M-6，兩組均為混合氨基酸與葡萄糖反應，僅反應底物不同，當反應底物為水時，香氣、豐濃大大降低，表明相較于直接以純水作為底物，使用煙葉殘渣水提物作為底物在增加香氣、豐富煙氣濃度等方面更有優(yōu)勢。因此綜合來看，美拉德反應的還原糖選擇葡萄糖，氨基酸選擇天冬氨酸和谷氨酸的混合氨基酸，反應底物為水提物。

2.2.2 氨基酸和還原糖摩爾比對美拉德反應香料感官質量的影響 在確定反應底物、氨基酸和還原糖的基礎上，通過單因素試驗考察氨基酸和還原糖摩爾比對Maillard反應產物感官品質的影響，結果如表2所示。整體而言，不同摩爾比條件下的各反應產物，在香氣、豐濃、刺激、細柔等品質特征上均有不同程度的改善；略增加甜味，降低苦味，綜合味覺略改善；風格特征主要表現(xiàn)在焦香、烘焙香、蜜甜香等方面。當葡萄糖用量過高時(n氨基酸∶n葡萄糖=2∶5)，雜氣、刺激性略有增強，同時香氣、豐濃略有降低；甜味增強、苦味降低；烘焙香增強，奶香、酸香、可可香略降低。由于美拉德反應過程中會產生大量的含N雜環(huán)，在增強烘焙香、增加煙氣濃度、增加香氣量方面會有較明顯作用，因而，在篩選最佳條件時，著重選擇對品質特征有重要改善，兼顧烘焙香、焦香等風格特征。當n氨基酸∶n葡萄糖=2∶1時，香氣、豐濃、雜氣的改善程度最高，同時，焦香、烘焙香也明顯增強，因而氨基酸和葡萄糖的用量確定為：天冬氨酸0.74 g、谷氨酸0.08 g、葡萄糖0.50 g。

表2 美拉德反應產物感官評價結果

2.2.3 反應時間對美拉德反應香料感官質量的影響 在n氨基酸∶n葡萄糖為2∶1，雪茄水提物10.0 g，溫度110 ℃，攪拌速度800 r/min的條件下，通過單因素試驗，對反應時間進行優(yōu)化。品質指標香氣和豐濃隨著反應時間的延長均呈先增加后降低的趨勢，不同的是，反應時間3.0 h時，香氣改善程度最高，而豐濃在反應時間為1.5 h時達到最高。與空白樣品相比，美拉德反應產物幾乎都有一定的雜氣，僅M-7略有降低雜氣與刺激性的作用。在味覺特征上，當反應時間為1.5 h時，酸味增加，延長或縮短反應時間均無較大改善；甜味基本上隨著反應時間的延長先增強后減弱，當反應時間為1.5 h甜味分值最高；綜合味覺改善較為明顯的是M-13和M-8。在風格特征方面，M-7的干草香、焦香、烘焙香突出。綜合考慮，最佳反應時間確定為3.0 h。

最終通過單因素試驗確定了美拉德反應最佳試驗條件：雪茄煙葉殘渣水提物10.00 g、天冬氨酸0.74 g、谷氨酸0.08 g、葡萄糖0.50 g，加熱至110 ℃反應3.0 h，反應結束后過濾去除不溶物即可。

2.3 美拉德反應香料的成分

2.3.1 美拉德反應香料定性分析 美拉德反應香料M-7的定性分析結果如表3所示，共鑒定出21種揮發(fā)性成分。采用同樣的方法對雪茄煙葉殘渣水提物進行分析，未檢出任何致香成分，說明利用美拉德反應能夠產生較多的香氣物質，提升水提物的使用價值。M-7中致香成分主要有糠醛、4-環(huán)戊烯-1,3-二酮、5-甲基呋喃醛、2-乙?；量?、2,5-呋喃二甲醛、5-羥甲基糠醛、苯乙醇、壬醛、3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮等，其中5-羥甲基糠醛的含量高達670.86 μg/g，其次為4-環(huán)戊烯-1,3-二酮(16.52 μg/g)、2,5-呋喃二甲醛(12.34 μg/g)和3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮(12.68 μg/g)，此外，5-甲基呋喃醛、糠醛、2-乙?；量┑暮恳蚕鄬^高。這些物質的特征香氣表現(xiàn)為烘烤香、甜香、堅果香，有良好的增香效果，正是這些物質的存在使得M-7在卷煙風格特征方面具有烘托烘焙香、焦香的作用，GC-MS的分析結果與感官評價結果具有很好的一致性。

表3 M-7中的揮發(fā)性香氣成分

2.3.2 美拉德反應香料定量分析 為進一步探明Maillard反應香料的化學成分隨反應條件的變化規(guī)律，結合文獻[8]以及表3的分析結果，對Maillard反應產物中的18種化學成分進行定量分析，結果見表4。由于煙草水提物中含一定量的還原糖和氨基酸，其自身也會發(fā)生Maillard反應，因而在同樣條件下與水提物自身的Maillard反應產物(M-0)進行對比分析。M-0中18種待測物的總量為209.73 μg/g，其中，5-羥甲基糠醛和2-乙?；量┑暮孔罡?，占總量的71.57%，與烤煙型煙草水提物的略有不同，烤煙型煙草水提物自身Maillard反應產物中羥基丙酮的含量僅次于5-羥甲基糠醛，可能與氨基酸種類的不同有關[8]。加入一定量的氨基酸和葡萄糖后，Maillard反應產物的含量大大增加，且總量隨著氨基酸與葡萄糖摩爾比的增加而增加，當摩爾比為2∶5時，總量為5 317.06 μg/g，是M-0的25.35倍。反應產物以5-羥甲基糠醛、2-乙酰基吡咯、羥基丙酮為主。其中，羥基丙酮的含量急劇上升，從最初的11.99 μg/g上升至121.92 μg/g(M-9)。與此類似的還有糠醛、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮。5-甲基糠醛和2,5-二甲酰基呋喃在M-0中未檢出，但隨著物料比的增加，其含量逐漸增加?？反?、2(5H)-呋喃酮隨著反應比例的增加，呈先增加后降低趨勢，當氨基酸與葡萄糖摩爾比為2∶3時，含量均達到最高值。3-乙?；拎るS著物料比的增加而降低，可能與反應體系中脯氨酸的含量較低，無法獲取足量的還原糖并與之發(fā)生反應有關。

表4 Maillard反應產物定量分析結果?

隨反應時間的延長，Maillard反應程度逐漸加深，反應產物的含量逐漸增加。反應時間3.0 h之前，5-羥甲基糠醛的含量緩慢增加，3.5 h時急劇上升，從685.22 μg/g增加至1 256.41 μg/g。與此相似的還有糠醛、羥基丙酮、5-甲基糠醛、2,5-二甲酰基呋喃和2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮。卷煙感官作用評價結果表明，反應時間為3.0 h時，反應產物對卷煙香氣質、香氣量、濃度等各方面的改善效果最佳，該條件下反應產物的總量為937.75 μg/g。

2.4 Maillard反應產物與卷煙感官指標的相關性

采用簡單相關分析方法對Maillard反應產物與卷煙感官指標之間的相關性進行研究，結果見表5。與細柔顯著相關的是2-乙酰基呋喃，與奶香顯著相關的是3-羥基-2-丁酮，極顯著相關的是3-乙?；拎ぃc花香顯著相關的是2-呋喃基羥基甲基酮和5-羥甲基糠醛，極顯著相關的是2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮。而6-乙基-5,6-二氫-2H-吡喃-2-酮與雜氣、刺激、苦味、干草香指標均顯著負相關。通常，Maillard反應產物在增加香氣量、香氣質、煙氣濃度和烘烤香、甜香方面有較大作用，但相關性分析并未找到與這些指標呈顯著或極顯著相關關系的成分，可能與感官評價分值之間的差異較小有關。

表5 Maillard反應產物與卷煙感官指標的相關性關系?

3 結論

在煙草提取物的生產過程中會產生大量的固體廢渣，而這些固體廢渣中仍含有糖、氨基酸等物質，對其進行二次利用，有利于降低原料成本，提高產品附加值；Maillard反應能夠利用糖源或氮源，轉化為致香成分，在卷煙中起到增加焦甜香或烘焙香的作用，使用價值遠遠高于煙草水提物。但影響Maillard反應的還有pH、溶劑組成等諸多因素，因此，有必要對煙草美拉德反應香料的工藝、化學成分及其影響因素進行深入探討，為產品深加工提供依據(jù)。