張藝欣 鄔旭然 何若菡 馮 碩 楊豐旗

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

天然低共熔溶劑(NADES)是由糖類、有機酸、氨基酸和膽堿衍生物等天然化合物按一定摩爾比組合后在一定條件下形成的低熔點液態(tài)混合物，其形成原理為氫鍵供體(HBD)與氫鍵受體(HBA)之間形成的氫鍵使電荷離域，導(dǎo)致混合物熔點降低，最終在室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的共晶體系[1]。Choi等[2]提出除水和脂質(zhì)外，細胞內(nèi)存在第三液相，即由糖、醇、氨基酸、膽堿衍生物相互作用形成的NADES。生物體內(nèi)NADES的存在可以解釋多種生物現(xiàn)象，如在細胞水環(huán)境中有難溶于水的代謝物的合成；一些植物可在極端條件下生存等。某些植物汁液如花蜜和楓糖漿，也被認為是天然存在的NADES[3]。NADES具有制備簡單、易降解、毒性低[4]等優(yōu)點，因而通常作為催化劑和萃取溶劑被應(yīng)用于分析化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，尤其是活性物質(zhì)的提取和分離研究。

酚類物質(zhì)是一類重要的植物次生代謝物。常用于萃取酚類物質(zhì)的溶劑為甲醇或乙醇，此類有機溶劑毒性高、易燃，而且提取過程中試劑消耗較多，易造成環(huán)境污染。NADES具有生物相容性、可調(diào)性、環(huán)境友好等優(yōu)勢，被認為是取代傳統(tǒng)有機溶劑的最佳替代品[4]。NADES超分子結(jié)構(gòu)上的羥基或羧基可與酚類化合物形成氫鍵，增加提取產(chǎn)量，同時氫鍵的形成可提高酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性[5]。一項研究[6]表明NADES中的許多酚類物質(zhì)可以保持穩(wěn)定長達60 d。文章擬對NADES用于酚類物質(zhì)提取的相關(guān)研究進行綜述，并總結(jié)影響提取效率的主要因素和產(chǎn)物回收的方法，以期為開發(fā)天然的酚類萃取溶劑提供參考。

1 NADES在酚類物質(zhì)提取中的應(yīng)用

NADES可以分為5類:由酸和堿合成的離子液體型；糖類或糖和多元醇合成的中性型；糖或多元醇與有機酸合成的中性酸型；糖或多元醇與有機堿合成的中性堿型；氨基酸和糖或有機酸合成的氨基酸型[7]。氯化膽堿(ChCl)屬于B族維生素之一，是最經(jīng)濟的膽堿合成形式，可作為大宗化學(xué)品大規(guī)模生產(chǎn)。ChCl的生物相容性較高，是目前常用的HBA[8]。根據(jù)酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為幾個亞組，包括黃酮類和酚酸類，以及姜黃素、木質(zhì)素等其他多酚。近年來，眾多研究人員以不同基質(zhì)材料為研究對象，應(yīng)用NADES探究酚類物質(zhì)的高效綠色提取方法。

1.1 黃酮類化合物

蘆丁是一種常見的膳食糖基類黃酮，F(xiàn)aggain等[9]報道，由谷氨酸/脯氨酸(摩爾質(zhì)量比為2∶1)和脯氨酸/ChCl(摩爾質(zhì)量比為1∶1)組成的NADES能有效溶解蘆丁。Huang等[10]研究表明，超聲波與NADES萃取相結(jié)合的方法可高效地從苦蕎殼中提取蘆??；蘆丁在13種氯化膽堿和甘油基NADES中的溶解度比在水中的提高了660～1 577倍，當(dāng)ChCl/Gly含水量為20%時，提取率最高為9.5 mg/g，提取率為95%。此外，該研究還對NADES的毒性和生物降解性進行了評價，發(fā)現(xiàn)NADES溶劑毒性極低，28 d后生物降解率為70%，可被歸類為易生物降解溶劑。

花青素屬于黃酮類化合物，是一種強效的自由基清除劑。研究[11]表明，花青素可抗氧化損傷，預(yù)防動脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥等疾病。Da Silva等[12]建立了一種環(huán)保、低成本的藍莓花青素提取方法，以ChCl/甘油/檸檬酸(摩爾比0.5∶2∶0.5)的三元NADES作溶劑，提取率約為76%。該研究小組[13]制備了總酚質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL 的藍莓提取物-NADES溶液進行大鼠喂養(yǎng)試驗，代謝動力學(xué)分析顯示CE-NADES通過延緩胃糜中和，提高了體內(nèi)消化過程中酚類化合物的穩(wěn)定性。Popovic等[4]研究發(fā)現(xiàn)花青素在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定性較高，在以ChCl為HBA，蘋果酸、尿素、果糖為HBD的3種溶劑體系中，40 ℃加熱攪拌，ChCl/蘋果酸體系的櫻桃果渣提取物中花青素的含量較高，而微波輔助方法提取速度快，時間小于5 min。但基于蘋果酸的NADES體系pH值過低，提取物的抗自由基活性較差。

Oomen等[14]研究發(fā)現(xiàn)4種含有檸檬酸的親水性NADES均能提取黃岑中的黃酮化合物，采用高效液相色譜法和高效薄層色譜法對提取物的化學(xué)成分進行定量分析，發(fā)現(xiàn)NADES中黃岑素類苷元含量是甲醇水溶液的3～5倍，相應(yīng)糖苷含量為甲醇水溶液的1.5～1.8倍。熊蘇慧等[15]使用NADES提取玉竹中的總黃酮，得到的最大提取率達18.79 mg/g，經(jīng)大孔樹脂吸附后NADES可被二次使用，回收利用率為94.56%。

1.2 酚酸及其他多酚

酚酸是一類常見的非類黃酮植物多酚，具有良好的抗氧化、抗菌活性，主要來源于水果、蔬菜、種子、芳香植物等。Juric等[16]評價了6種ChCl基NADES對薄荷葉多酚的提取效率，發(fā)現(xiàn)山梨醇/ChCl體系提取物中羥基肉桂酸含量較高，以有機酸為HBD的兩種NADES對酚酸的萃取能力優(yōu)于其他NADES。此外，體外抗氧化試驗結(jié)果表明，6種NADES提取液的DPPH自由基清除能力均優(yōu)于70%乙醇，這可能是由于體系中的氫鍵提高了酚類化合物的穩(wěn)定性。郁峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)從杜仲葉中提取綠原酸的較優(yōu)溶劑體系為甜菜堿/L-乳酸/水(物質(zhì)的量比為1∶1∶4)，萃取條件優(yōu)化后的綠原酸得率為31.46 mg/g，提取物對 DPPH·、ABTS·和·OH 均有較強的清除能力。

Alsaud等[18]提出了一種疏水型低共熔溶劑，將薄荷醇與乳酸按摩爾比1∶2混合得到的溶劑可從麥盧卡葉片中同時提取兩種極性差異較大的活性物質(zhì)：半萜烯類和酚類，提取物總酚含量低于傳統(tǒng)溶劑乙醇，但其抑菌效果優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑。Doldolova等[19]制備了以ChCl、乳酸、果糖和蔗糖為溶劑原料的5種二元組合NADES，利用微波輔助(MAE)從姜黃中提取姜黃素，采用響應(yīng)面法對MAE參數(shù)進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)溫度是影響姜黃素提取的最重要因素。優(yōu)化萃取條件后,采用銅離子還原能力法(CUPRAC)對提取物最大總抗氧化能力(TAC)進行測定，除果糖/ChCl外，其余NADES提取物TAC均高于80%甲醇。

綜上，基質(zhì)材料所含酚類化合物類型各不相同，選擇合適的NADES種類，調(diào)節(jié)氫鍵供體與受體比例，并優(yōu)化萃取條件，可取得較好的提取效果。更多應(yīng)用舉例總結(jié)于表1。

2 NADES提取酚類物質(zhì)的影響因素

2.1 NADES組成及摩爾比例

NADES組分和組分之間的摩爾比例決定了共晶體系的液態(tài)穩(wěn)定性。氫鍵受體與供體基團數(shù)量、空間結(jié)構(gòu)和鍵的位置均對NADES的形成有顯著影響。若組分中有額外的羥基和羧基存在，則分子間可以形成更多氫鍵，易形成穩(wěn)定性較高的共晶體系。如琥珀酸不能與膽堿形成液體，但含羧基較多的檸檬酸和蘋果酸可以。若組分之間的摩爾比例不當(dāng)，NADES會出現(xiàn)固體結(jié)晶。高黏度是NADES的重要特征，但黏度過高不利于傳質(zhì)，不僅會降低提取效率，還會影響酚類提取物的分離純化。分子大小和組分之間的相互作用力是影響共晶體系黏度的主要因素，如含有一個羧基的乳酸基NADES，黏度低于含3個羧基的檸檬酸基NADES；小分子的多元醇基溶劑黏度低于糖或有機酸基溶劑[30]。短小結(jié)構(gòu)或多羧酸結(jié)構(gòu)的HBD更容易與多酚靶標(biāo)化合物相互作用，使提取產(chǎn)量增加。

HBA與HBD的性質(zhì)決定了NADES的極性及pH值。溶劑極性是影響萃取效率的最重要因素，NADES極性越接近目標(biāo)物，提取可能性越高。NADES極性范圍廣泛[2]，有機酸基NADES表現(xiàn)出與水相近的高極性，氨基酸和醇基NADES次之[31]。NADES的pH值是影響提取效率的另一因素，當(dāng)溶劑pH值略低于酚類物質(zhì)的pKa，酚類化合物在溶劑中處于中性狀態(tài)時更容易被提取。酸基NADES對花青素、兒茶素和綠原酸表現(xiàn)出較高的提取親和力[7,16]。

受體與供體比例也會影響酚類物質(zhì)與溶劑組分之間形成氫鍵。NADES乳酸百分比為35%時，提取物呈現(xiàn)出最高的TPC，乳酸比例升高至75%時，提取量下降。相比乳酸陰離子，酚類物質(zhì)更容易與氫受體鍵中膽堿季陽離子形成氫鍵，系統(tǒng)中添加過多乳酸，會削弱目標(biāo)物與膽堿之間的氫鍵作用，乳酸相對于膽堿含量越多，酚類物質(zhì)的提取量就越少[26]。

2.2 NADES水分含量

NADES的含水量會通過影響共晶系統(tǒng)的黏度從而影響提取效率。在NADES制備過程中加水或制備后提取前用水稀釋NADES可降低體系黏度，有利于萃取過程中更好地傳質(zhì)。水分含量還會影響NADES的極性，通過添加特定量的水使NADES溶劑極性與目標(biāo)提取物相似，就可以實現(xiàn)最佳的萃取效率。過量的水會削弱NADES分子間的氫鍵結(jié)構(gòu)，通常加水量為20%～50%[31]。每一種提取方法的變量不同，因此需要根據(jù)實際組分與基質(zhì)材料的性質(zhì)確定最優(yōu)含水量。

表1 NADES用于酚類物質(zhì)提取

2.3 其他因素

2.3.1 萃取溫度 通常NADES黏度隨溫度升高而降低，當(dāng)溫度升高時，分子自由運動，NADES組分間的氫鍵作用和范德華力減弱，體系黏度下降。適當(dāng)提高萃取溫度可促進生物質(zhì)細胞的滲透以及溶劑與目標(biāo)化合物之間的相互作用，能夠使目標(biāo)物更快地擴散到溶劑中。酚類物質(zhì)多為熱敏性的，理想萃取溫度為25～60 ℃。

2.3.2 輔助提取方法 目前常用的輔助方法有超聲輔助(UAE)、微波輔助(MAE)、加熱攪拌(H&S)等。UAE是通過空化作用，增加溶劑穿透力，加速提取過程，提高提取量[32]；MAE具有提取時間及短，溶劑消耗少等優(yōu)勢。UAE和MAE的設(shè)備功率、提取時間等都是影響提取效率的重要因素。

2.3.3 液固比 液固比是容易對提取率產(chǎn)生負效應(yīng)值的一個變量，過量的溶劑會增加介質(zhì)中的溶氧量，增加酚類物質(zhì)的氧化；液固比過低時，過量的固體導(dǎo)致溶劑飽和，不利于傳質(zhì)[26]。

3 酚類物質(zhì)的回收及溶劑的重復(fù)利用

NADES作為合成溶劑，成本相對較高，溶劑的回收是十分必要的。反溶劑法、大孔樹脂吸附和固相萃取是近幾年常用的從提取液中分離目標(biāo)物的方法。反溶劑法操作相對簡單，在提取液中添加反溶劑，稀釋的NADES與目標(biāo)化合物間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)斷裂，離心后酚類物質(zhì)形成沉淀與溶劑分離；上層富溶劑相可通過減壓蒸餾等方法實現(xiàn)再生。Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水是測試溶劑中最有效的抗溶劑，蘆丁回收率為95.1%，回收后ChCl/Gly的3次再萃取效率分別為原溶劑的92%,87%,81%。20倍的水作為反溶劑，可分離提取液中的姜黃素[2]。Mamilla等[33]選用丙酮作為反溶劑，從提取液中分離木質(zhì)素、木纖維素，DES以固體狀態(tài)被回收。

Tian等[34]提出了一種從低共熔溶劑(DES)中回收黃酮類化合物的新策略，向體系中加水稀釋到10%，然后加入一種鉻金屬有機框架MIL-100 (Cr)，使目標(biāo)化合物吸附在MIL上實現(xiàn)目標(biāo)物與溶劑的分離。

樹脂吸附法是一種簡單有效的活性物質(zhì)回收方法，利用大孔樹脂吸附酚類物質(zhì)，NADES極性成分用水洗脫。Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂具有較高的吸附/解吸性能，刺五加總黃酮類化合物的回收率高達(71.56±0.256)%，DES溶劑可以有效地重復(fù)使用兩次。研究人員結(jié)合NADES特性，嘗試合成對目標(biāo)物選擇性更高的新型固相吸附材料。Fu等[36]采用熱水聚合法合成ChCl-Ph DES改性吸附劑作為SPE填料，相比傳統(tǒng)C18色譜柱，它可以從棕櫚樣品中分離出更大量酚類化合物，并且經(jīng)5次循環(huán)使用后仍表現(xiàn)良好的可逆性。Gao等[37]采用環(huán)保型深共熔溶劑和COF(共價有機框架)成功制備了高結(jié)晶度的COF-DES，基于COF-DES的SPE色譜柱在實際樣品中對黃酮類化合物具有更好的吸附和選擇性能。

此外，NADES可以作為酚類物質(zhì)的配方載體，繞開溶劑的回收過程，直接應(yīng)用于食品、化妝品及制藥領(lǐng)域。例如Kyriakidou等[38]向殼聚糖基可食性薄膜中加入ChCl/Gly 石榴皮提取物，作為助劑改善膜的性能。NADES米糠提取物作為脂質(zhì)抗氧化劑加入O/W納米乳液中表現(xiàn)良好的抗氧化活性，iCALB生物轉(zhuǎn)化提取物似可促進這種抗氧化效率。

4 總結(jié)與展望

天然低共熔溶劑具有低毒性、可調(diào)性、極性范圍廣、環(huán)保等特點，可作為不同基質(zhì)中酚類物質(zhì)綠色萃取溶劑，相比傳統(tǒng)有機溶劑，天然低共熔溶劑組分可以與酚類物質(zhì)形成氫鍵從而獲得更高提取量，并且可保持酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性。天然低共熔溶劑組分及摩爾比、加水量、溫度等因素都會影響提取效率。天然低共熔溶劑對酚類物質(zhì)的提取效率雖優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑，但其具有黏度高、蒸氣壓低、成本高的缺點，另外，酚類物質(zhì)與天然低共熔溶劑組分間存在的氫鍵網(wǎng)絡(luò)使得提取后溶質(zhì)的分離純化過程存在一定困難。因此，酚類物質(zhì)提取后的純化和溶劑回收可作為未來研究的優(yōu)選課題。

高黏度是限制天然低共熔溶劑作為萃取溶劑應(yīng)用的主要缺點，可以通過提高溫度或向體系中加水來降低其黏度，后續(xù)研究可探索更多天然產(chǎn)物組合設(shè)計低黏度天然低共熔溶劑。目前評價其提取效率的指標(biāo)集中在總酚、總黃酮含量及抗氧化活性，從分子結(jié)構(gòu)、作用機制等微觀層面探究溶劑對某種酚類物質(zhì)的選擇性可作為進一步研究方向。此外，天然低共熔溶劑在提高酚類化合物的生物利用度方面也表現(xiàn)出優(yōu)越性，其成分為天然代謝物，可作為目標(biāo)物的載體直接應(yīng)用于生產(chǎn)，而不需要進一步分離。關(guān)于天然低共熔溶劑安全性評價，目前多數(shù)研究采用體外細胞毒性測試的方法，天然低共熔溶劑對活性物質(zhì)體內(nèi)代謝的影響以及體內(nèi)安全性需進一步闡明。隨著未來研究的不斷深入，天然低共熔溶劑有望成為新型綠色多功能溶劑，在天然活性產(chǎn)物提取及應(yīng)用領(lǐng)域，實現(xiàn)多種用途。