曲景成,曲景雙,丁 偉

(東北石油大學化學化工學院 石油與天然氣省化工重點實驗室,黑龍江 大慶 163318)

傷口愈合是一個動態(tài)過程,敷料的性能要求會隨著愈合的進展而變化。傳統(tǒng)敷料用于傷口處理,其主要功能是讓傷口滲出液蒸發(fā),防止有害細菌進入,從而保持傷口干燥。然而,溫暖潮濕的環(huán)境才有助于快速愈合,大多數(shù)現(xiàn)代傷口敷料產(chǎn)品的設計都是為了滿足這些條件[1-2]。Quinn[3]、Kane[4]、Choi[5]、Li[6]、Azad[7]、Kicho[8]等制備了聚環(huán)氧乙烯和水、瓊脂和聚丙烯酰胺、聚乙烯醇組成的海綿、聚氨酯泡沫、聚四氨乙烯薄膜、美樂林等復合敷料。

水凝膠是三維(3D)、不溶性、交聯(lián)的組織狀聚合物網(wǎng)絡,能夠在膨脹狀態(tài)下保留大量水[9-11],增加其體積,并表現(xiàn)出大量不同的材料行為。自20世紀60年代首次實際應用以來,已被應用于生物醫(yī)學的多個領域[12-14]。在傷口敷料[15-16]中水凝膠結(jié)合了濕潤傷口愈合和液體吸收良好的特點,并且透明,可以有效監(jiān)測愈合情況。

在最近的一項研究中,發(fā)現(xiàn)通常在水凝膠的制備中由于使用有毒性的交聯(lián)劑,難以應用于含有活細胞的構(gòu)建體。而高碘酸鹽氧化海藻酸鹽和明膠之間不需要加入交聯(lián)劑就能迅速產(chǎn)生原位形成的水凝膠,無毒且可生物降解,證明了其作為可注射原位形成支架用于組織工程和藥物輸送的潛力。藻酸鹽和明膠都已用于許多生物醫(yī)學應用,例如傷口敷料、組織工程和藥物輸送[17]。而海藻酸鹽明膠水凝膠由于其較低的機械強度在醫(yī)學領域中并未得到廣泛的應用[18]。因此作者研究制備了一種摻雜生物活性玻璃且能夠自修復的水凝膠。首先原位合成氧化海藻酸鈉/明膠(OSA/Gelatin)水凝膠,再將不同粒徑大小的生物活性玻璃(BG)摻雜到上述所制備的OSA/Gelatin水凝膠中。該材料具有許多傷口敷料所需要的關鍵元素,如良好的吸水性能、自修復性能、最佳的水蒸氣透過率、降解性能和力學性能等。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉(SA)、高碘酸鈉、明膠、蘇丹明B、無水乙醇、乙二醇:分析純,阿拉丁(上海)試劑有限公司;生物活性玻璃(納米級BG-1)[19]、生物活性玻璃(微米級BG-2)[20]、去離子水:實驗室自制。

核磁共振氫譜儀(1HNMR):AVANCE400,JEOL日本;場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM):Vega 3,Tescan,德國卡爾蔡司股份公司;傅里葉變換紅外光譜儀:Tensor-27,沈陽萬方中通商貿(mào)有限公司;流變儀:MCR 501S,奧地利Anton Paar;X射線衍射儀:D/MAX 2200,牛津儀器公司;萬能試驗機:WDW-5,蘇州泛思儀器設備有限公司。

1.2 生物活性玻璃/海藻酸鹽/明膠水凝膠的合成

氧化海藻酸鈉(OSA)的制備。將1 g海藻酸鈉和5 m L乙醇在磁力攪拌的狀態(tài)下形成比較分散的懸濁液,為溶液A;然后將一定量的高碘酸鈉和去離子水避光制成0.5 mol/L的溶液B;將B溶液緩慢加入A中,黑暗條件下繼續(xù)反應5 h,終止反應時加入乙二醇溶液終止15 min,得到溶液C,再將溶液C倒入透析袋中用去離子水透析3 d,定時更換去離子水,透析后倒入表面皿中,在－20℃的冰箱中預冷凍12 h并將樣品放在－70℃的凍干機中進行冷凍干燥,從而獲得OSA白色樣品。n(高碘酸鈉)∶n(SA)＝0.2,試樣記為OSA-1,n(高碘酸鈉)∶n(SA)＝0.6,試樣記為OSA-2。

生物活性玻璃/海藻酸鹽/明膠(BG/OSA/Gelatin)水凝膠的合成。稱取適量的明膠加入到去離子水中,t＝50℃水浴鍋中磁力攪拌,待完全溶解后,再加入0.05 g的生物活性玻璃粉末,繼續(xù)攪拌使其均勻分散。溫度下降至37℃加入一定量的OSA,反應一段時間后將攪拌均勻的混合液倒置于模具中,于37℃恒溫箱中10 min,即可得到BG/OSA/Gelatin。選用BG-1、OSA-1、明膠所制備的水凝膠為水凝膠1;BG-2、OSA-1、明膠所制備的水凝膠為水凝膠2,選用BG-1、OSA-2、明膠所制備的水凝膠為水凝膠3,BG-2、OSA-2、明膠所制備的水凝膠為水凝膠4。

1.3 表征與測試

1.3.1 結(jié)構(gòu)表征

以氧化氘為溶劑,用1H NMR對聚合物的化學結(jié)構(gòu)進行了表征,測試條件為400 MHz。采用溴化鉀壓片法,通過傅里葉紅外光譜儀在室溫下對BG、OSA、Gelatin和 所 制 備 的BG/OSA/Gelatin水凝膠樣品進行測試,波數(shù)為500~4 000 cm－1。

1.3.2 水凝膠形貌表征

為了表征水凝膠的微觀結(jié)構(gòu),通過在20 k V下操作的SEM觀察冷凍干燥和破裂的水凝膠碎片。在觀察之前,樣品表面噴金處理。

1.3.3 水凝膠流變性能測試

用流變儀研究了BG/OSA/Gelatin水凝膠在37℃振蕩模式下的流變行為,頻率掃描測試為0.1~100 rad/s。

1.3.4 水凝膠自修復性能測試

將水凝膠制成直徑為20 mm,高為5 mm的圓柱體并用羅丹明B染色,然后將染色的水凝膠和未染色的水凝膠從中間切開并拼接到一起,t＝25℃放置一定時間后,觀察BG/OSA/Gelatin水凝膠的自修復性能。

1.3.5 水凝膠吸水性能測試

將4種水凝膠浸泡在Na2HPO4·KH2PO4·NaCl和KCl(PBS)緩沖液中,t＝37℃浸泡一段時間取出后用濾紙擦掉樣品上多余水分,稱其質(zhì)量,間隔一段時間再進行稱量,若稱取樣品的質(zhì)量未增加,則認為水凝膠已達到溶脹平衡,溶脹平衡后的質(zhì)量記為mw。然后將樣品預冷凍6 h,在－70℃的冷凍干燥機進行冷凍干燥后所得固體稱重,記為mD。水凝膠的吸水率見式(1)。

1.3.6 水凝膠力學性能測試

(1)拉伸實驗。將未加入生物活性玻璃制備成的水凝膠和加入生物活性玻璃的4種水凝膠試樣制成為長條狀,長、寬、高分別為40、13、2 mm,拉伸速度為10 mm/min,直至試樣斷裂,得到水凝膠傷口敷料的抗拉強度。

(2)壓縮實驗。將4種水凝膠制成直徑為10 mm,高為5 mm的圓柱體。新制的樣品在潮濕條件下測量,壓縮速率為1 mm/min,壓至水凝膠破裂或加載到最大壓力,可得到其破裂強度。每個樣品取3次測量的平均值。

1.3.7 水凝膠降解性能測試

利用p H＝7.4的PBS溶液作為模擬體液,測定水凝膠體外降解性能。將1.2制得的水凝膠冷凍干燥處理,獲得凍干水凝膠,稱其質(zhì)量記為m1,之后將其浸泡在PBS溶液中,放置在37℃恒溫箱中。一段時間后,將水凝膠試樣從PBS溶液中取出并進行冷凍干燥,稱其質(zhì)量記為m2,降解過程中試樣的質(zhì)量損失率見式(2)。

1.3.8 水凝膠水蒸氣透過率(WVTR)測試

采用標準方法ASTM E96對復合水凝膠試樣測試其水蒸氣透過率(WVTR)。首先,在玻璃瓶中加入3 g CaCl2,作為吸水劑。將樣品固定在玻璃瓶上,測量瓶口直徑記為2R,將裝有CaCl2的玻璃瓶烘干至質(zhì)量恒定并稱量,記為m3,再將裝有CaCl2的玻璃瓶放在恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中,溫度為37℃。24 h后,稱量裝有CaCl2的玻璃瓶質(zhì)量,記為m4。復合水凝膠的水蒸氣透過率計算見式(3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠的合成與表征

OSA的制備原理見圖1。高碘酸鈉具有強氧化性,能夠氧化具有鄰羥基的結(jié)構(gòu),使其氧化成醛基或酮。

圖1 氧化海藻酸鈉制備原理

SA、OSA、Gelatin、BG、BG/OSA/Gelatin水凝膠的紅外譜圖見圖2。

圖2 SA、OSA、GeIatin、BG、BG/OSA/GeIatin水凝膠的紅外譜圖

由圖2可知,與SA紅外譜圖相比,1 733 cm－1出現(xiàn)了新的特征峰,為醛基的伸縮振動吸收峰,表明對海藻酸鈉改性成功。OSA在1 733 cm－1醛基特征振動吸收峰在Gelatin的譜圖上消失,說明在Gelatin的形成過程中形成新的化學鍵。Gelatin由于含有酰胺鍵,1 645、1 401 cm－1均出現(xiàn)了特征峰。而Gelatin的紅外譜圖上1 415 cm－1出現(xiàn)了應歸屬于Schiff堿結(jié)構(gòu)的新的強吸收峰。BG在1 057、1 673、1 986 cm－1的振動吸收峰均在Gelatin 1 148、1 621、2 476 cm－1發(fā)生了紅移和藍移。表明BG與Gelatin/OSA之間產(chǎn)生了非共價鍵作用。4種水凝膠的紅外譜圖中均有相應的官能團對應,所以只選擇1種水凝膠為例。

SA、OSA的核磁共振氫譜圖見圖3。

圖3 SA、OSA核磁共振氫譜圖

由圖3可知,δ＝4.45為溶劑重水的質(zhì)子吸收峰,δ＝5.14、5.57為醛基與羥基結(jié)合形成的半縮醛質(zhì)子吸收峰,核磁譜圖進一步表明成功制備了OSA。

2.2 水凝膠微觀形態(tài)分析

4種復合水凝膠的掃描電鏡圖見圖4。

由圖4可知,試樣具有多孔結(jié)構(gòu)且彼此連通,說明組分間的相容性較好。其中水凝膠1和2中的海藻酸鈉氧化度較低導致孔徑較大,而水凝膠3比水凝膠1所形成的網(wǎng)絡更致密是由于水凝膠3中SA的氧化度較大,同一區(qū)域內(nèi)水凝膠試樣的多孔結(jié)構(gòu)不斷增加,這是由于氧化度大的SA為明膠提供了更多的交聯(lián)位點,使OSA中的醛基增多,與明膠中的氨基形成的亞胺鍵變多,水凝膠交聯(lián)密度變大,同一區(qū)域內(nèi)多孔結(jié)構(gòu)變多,孔徑變小。摻入BG-2后,孔徑有所增大,可能是BG-2的粒徑較大,影響了OSA的醛基與明膠的氨基相遇的幾率,使其結(jié)合不夠緊密,因此孔徑增大。

圖4 4種復合水凝膠的微觀形貌

2.3 水凝膠流變學分析

4種復合水凝膠的振幅掃描曲線見圖5。

由圖5可知,4種復合水凝膠在不同頻率下的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化,G′是指黏彈行為的彈性部分,G″是指黏彈行為的黏性部分,若G′＞G″,樣品具有類凝膠或固體結(jié)構(gòu)。反之,樣品則具有流體結(jié)構(gòu)。

圖5 4種復合水凝膠的不同頻率下模量變化

振幅掃描測試表明,所有凝膠體在線性黏彈區(qū)范圍內(nèi)G′均大于G″,表明所制備出的樣品在此頻率范圍內(nèi)具有凝膠結(jié)構(gòu)且水凝膠的黏彈行為一直是以彈性行為為主。水凝膠強度由線性黏彈區(qū)的G′值確定,凝膠強度與凝膠中氧化海藻酸鈉與明膠的交聯(lián)程度和生物活性玻璃粒徑大小有關,海藻酸鈉的氧化度均加,與明膠交聯(lián)程度越大,交聯(lián)密度增加使凝膠強度越大。在較大變形時,隨著BG-1的加入,水凝膠的儲能模量增大,這是因為BG-1粒子均勻分散在水凝膠中,起到強化的作用,同時BG-1的加入也提高了交聯(lián)的密度,使水凝膠的內(nèi)部網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更加完善,抗變形能力增強。在整個振幅范圍內(nèi),G′始終大于G″,總體呈相互平行的趨勢,具有頻率穩(wěn)定性,表明具有穩(wěn)定的化學交聯(lián)結(jié)構(gòu)。綜上所述,通過流變測試顯示,所制備的復合水凝膠均具有良好的交聯(lián)結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出好的凝膠行為。

2.4 水凝膠自修復性能分析

由于所制備的水凝膠為化學型原位形成的水凝膠,而化學型水凝膠是指在凝膠分子內(nèi)部引入化學鍵。由于BG/OSA/Gelatin水凝膠是通過席夫堿反應(化學交聯(lián))所制備的,其中形成了動態(tài)的亞胺鍵,當外力使亞胺鍵斷裂時,可以通過再次接觸產(chǎn)生新的亞胺鍵,實現(xiàn)了水凝膠自修復,見圖6。

圖6 水凝膠自修復過程

由圖6可知,BG/OSA/Gelatin水凝膠具有良好的自修復性能。首先,將圓形水凝膠試樣切割成兩半,其中一半用羅丹明B染色劑將其染成紅色,另一半則是水凝膠試樣本身的顏色,之后將2個半塊水凝膠進行拼接放在25℃恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中,6 h后觀察到水凝膠的拼接處變得模糊,8 h后透明的水凝膠幾乎變成紅色。24 h后將拼接的水凝膠用鑷子夾起并進行輕微的晃動,拼接的水凝膠不會斷裂且拼接界面消失,證明了水凝膠的自修復性能。當氧化海藻酸鈉與明膠不能發(fā)生反應時3種原料也可以通過非共價鍵作用(物理交聯(lián))完成自修復,但氫鍵的作用力較弱,48 h后的水凝膠通過氫鍵作用的自修復程度,與BG/OSA/Gelatin水凝膠相比自修復過程較慢,整個水凝膠還未變成紅色。

2.5 水凝膠吸水性能分析

水凝膠吸水率見表1。

表1 水凝膠的吸水率

BG/OSA/Gelatin水凝膠無論是在去離子水中還是PBS溶液中經(jīng)過長時間的浸泡都會達到溶脹平衡。這可能是由于明膠與OSA的結(jié)合方式有關,兩者通過Schiff反應鍵合。由表1可知,隨著SA的氧化度越大,在與明膠反應時,生成水凝膠的交聯(lián)度就越大,凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)趨于緊密,容納水的空間變小,所以吸水率變低。而摻雜生物活性玻璃的水凝膠在去離子水和PBS溶液未出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,表明摻雜生物活性玻璃的水凝膠有更好的結(jié)合強度。這可能與BG中含有鈣元素有關,在溶液長時間浸泡時,BG的鈣會以Ca2＋的形式溶出,然后與未氧化的海藻酸鈉G單元進行離子交聯(lián),使水凝膠的交聯(lián)程度得到增強,形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的水凝膠,從而不易在溶液中溶解。圖4中不同交聯(lián)程度的復合水凝膠SEM圖片也顯示出,復合水凝膠隨著交聯(lián)程度降低,網(wǎng)絡中的孔會增大。而較大孔結(jié)構(gòu)自然能夠吸附更多的水分子,增大材料的吸水率。

2.6 水凝膠力學性能分析

水凝膠的拉伸強度見圖7,a為未加入BG且SA氧化度最低時所制備的OSA/Gelatin水凝膠,b為未加入BG且SA氧化度最高時所制備的OSA/Gelatin水凝膠,c為水凝膠1,d為水凝膠2,e為水凝膠3,f為水凝膠4。

由圖7可知,水凝膠1和水凝膠2隨著OSA的氧化度增大,拉伸強度增大,由86 k Pa增長到168 k Pa,這是由于OSA的氧化度升高,活性醛基量增多,與明膠更容易發(fā)生席夫堿反應,從而使水凝膠網(wǎng)絡交聯(lián)更緊密,結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,拉伸能力更強。OSA/明膠水凝膠隨著BG的摻入,其拉伸強度都比未加入BG的水凝膠拉伸強度高。水凝膠1和水凝膠2的拉伸強度存在較小的差異,是因為BG-1的粒徑較小且在制備BG-1時加入聚乙二醇分散劑使顆粒分散的更均勻,在有機相的分布明顯更為均勻,而BG-2在水凝膠有機相分布較差,顆粒較大容易團聚影響了水凝膠的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的形成,從而影響了水凝膠的拉伸性能。同理水凝膠3和水凝膠4的現(xiàn)象與結(jié)論與此相同。其中,水凝膠3的拉伸性能最好,拉伸強度達到206 k Pa。

圖7 水凝膠的拉伸強度

4種水凝膠在軸向方向上進行壓縮測試所得的壓縮模量見圖8。

圖8 水凝膠的壓縮模量

由圖8可知,氧化度增大,使OSA的活性醛基量增多,水凝膠的交聯(lián)度升高,水凝膠網(wǎng)絡交聯(lián)點之間的鏈段長度縮短,鏈段的活動能力減弱,同時分子鏈之間的作用力加強,因此抵抗外力的能力增強。BG使復合水凝膠的力學性能得到提高,壓縮變形量達到90%,水凝膠發(fā)生破裂,復合水凝膠的最大壓縮強度分 別為18.78、16.57、84.37、79 k Pa。當SA的氧化度越高,BG粒徑越小時復合水凝膠3的抗壓強度最大(84.37 kPa)。復合水凝膠力學性能的提高主要是因為BG顆粒耐壓強度較水凝膠高,其本身具有良好的力學性能,因此摻雜BG提高了壓縮模量。因為BG-1在溶液中分散較好更易與未氧化的海藻酸鈉G單元進行離子交聯(lián),使水凝膠的交聯(lián)程度得到增強,形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的水凝膠,所以當海藻酸鈉的氧化度相同時,摻雜BG-1的水凝膠抗壓強度越大。

2.7 水凝膠的降解性能分析

BG、SA都具有良好的生物可降解性,廣泛應用于生物醫(yī)用材料。水凝膠應用于創(chuàng)傷敷料時,若降解速率過快,會導致敷料降解在傷口處,使傷口感染。模擬人體體內(nèi)生理環(huán)境進行體外降解實驗,將4種復合水凝膠置于PBS溶液中,進行15 d降解測試,見圖9。

圖9 水凝膠的體外降解圖

由圖9可知,隨降解時間的延長水凝膠的質(zhì)量損失逐漸增大。其中水凝膠2的降解速度最快,1 d損失約為總質(zhì)量的43%,而水凝膠3降解率最低,1 d損失約為總質(zhì)量的16%,10 d降解速率變慢,在降解15 d后,4種水凝膠的質(zhì)量損失分別達到79%、74%、61%和58%。這是由于海藻酸鈉的氧化度越高,與明膠發(fā)生反應時生成水凝膠的交聯(lián)度就越大,交聯(lián)度變大增加了分子的空間位阻效應,水凝膠的降解速度變緩。水凝膠1和水凝膠2降解速率也有一些差別,是因為生物活性玻璃的加入,BG中含有鈣元素,在溶液長時間浸泡時,BG的鈣會以Ca2＋的形式溶出,然后與未氧化的海藻酸鈉G單元進行離子交聯(lián),使水凝膠的交聯(lián)程度得到增強,由于BG-1中Ca2＋較多,所以水凝膠1降解速度變緩。同理水凝膠3和水凝膠4也具有相同的情況。

2.8 水凝膠的水蒸氣透過率分析

創(chuàng)傷敷料的WVTR過高會導致傷口脫水,而過低的WVTR可引起創(chuàng)面滲出物的積累與覆蓋。Lamke等[21]報道了正常皮膚的蒸發(fā)失水為(204±12)g/(m2·d),而受傷皮膚的蒸發(fā)失水范圍從一度燒傷的(279±26)g/(m2·d)到顆粒狀傷口的(5138±202)g/(m2·d)。水凝膠水蒸氣透過率見圖10。

圖10 水凝膠的水蒸氣透過率

由圖10可知,4種復合水凝膠的WVTR測試中,水凝膠3最低,僅為2 563.44 g/(m2·d),水凝膠2最高,可達4 456.29 g/(m2·d)。這表明,復合水凝膠能夠保持皮膚水分不會流失過快,具有一定的保濕能力。對比不同復合水凝膠,發(fā)現(xiàn)影響WVTR的直接因素是隨著氧化劑(高碘酸鈉)的量增加,氧化度升高,在與明膠反應時,生成水凝膠的交聯(lián)度增大,凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)趨于緊密,導致復合水凝膠的WVTR降低。間接因素是摻雜的BG中含有鈣元素,在溶液長時間浸泡時,BG中的鈣會以Ca2＋的形式溶出,然后與未氧化的SA G單元進行離子交聯(lián),使水凝膠的交聯(lián)程度得到增強,形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的水凝膠,從而導致復合水凝膠的WVTR降低。裸露皮膚的WVTR為4 800 g/(m2·d),而復合水凝膠的WVTR為2 563.44~4 456.29 g/(m2·d),可 使人體水分不會通過傷口快速流失,為受傷創(chuàng)面提供一個濕潤環(huán)境,有助于創(chuàng)傷愈合,且適中的WVTR,還有利于傷口與外界環(huán)境進行氧氣的交換。綜上,復合水凝膠的WVTR較好,在用作傷口敷料可以保證傷口與外界的氣體交換,保持創(chuàng)面濕潤,促進創(chuàng)傷恢復。

3 結(jié) 論

(1)通過比較氧化前后的SA紅外吸收光譜和核磁共振氫譜可以看出,高碘酸鈉成功氧化了SA分子鏈,從而改變了SA的結(jié)構(gòu),從SEM可看出水凝膠為三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),而摻雜粒徑小的生物活性玻璃所制備的水凝膠網(wǎng)絡更致密;

(2)由于水凝膠中引入了動態(tài)亞胺鍵使水凝膠獲得良好的自修復性能,通過測試發(fā)現(xiàn)水凝膠3在斷裂后24 h完成了自修復,而未引入動態(tài)亞胺鍵的水凝膠自修復過程較慢;

(3)SA氧化度的增大和粒徑較小且分散較好的生物活性玻璃均可提高化學交聯(lián)SA/Gelatin水凝膠的拉伸強度和壓縮模量,水凝膠3的拉伸強度和壓縮強度分別為206 k Pa和79 kPa;

(4)作為敷料,所制備的4種水凝膠也有良好的保水能力且水凝膠的WVTR的測定表明水凝膠有良好的保濕能力,用作傷口敷料可以保證傷口與外界的氣體交換,保持創(chuàng)面濕潤,促進創(chuàng)傷恢復。