張 劍,鄭志鴻,張 博,張寧寧,唐新萍,李一冰,夏敏珠,劉春葉

(西安醫(yī)學院 藥學院,陜西 西安 710021)

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物,具有多種生物活性,如抗炎、減壓、保肝、降脂、抗氧化、抗腫瘤等[1-2]。因此,黃酮類物質簡便、快速、準確地檢測方法近年來受到研究人員的廣泛關注。

黃酮類化合物的傳統(tǒng)檢測方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法、紅外光譜法、熒光分析法、毛細管電泳法等。這些方法準確且重現(xiàn)性好,但均需要大型分析儀器,對設備和操作要求較高,試劑消耗量大,分析時間長,不能及時進行現(xiàn)場檢測[3-5]。微流控紙芯片技術是近幾十年發(fā)展起來的新技術,旨在把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、分離檢測、生物與化學反應等基本操作集成到紙芯片上,用以完成不同的生物或化學反應過程,并對其產物進行分析[6-9]。該方法在紙芯片上實現(xiàn)進樣、檢測等全部實驗流程,是一個集分析檢測于一體的微型實驗分析平臺。與傳統(tǒng)檢測方法相比,微流控紙芯片無需依賴附加大型檢測儀器,操作簡便、成本低廉、攜帶方便,能使檢測更經濟、實用、便捷[10-13]。目前,技術尚未用于黃酮類化合物的檢測分析。作者旨在建立一種基于紙芯片的黃酮類化合物快速測定方法,為中藥成分含量測定提供新思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

蘆丁:純度≥98.0%,上海源葉生物科技有限公司;甲醇、氫氧化鈉:分析純,天津市河東區(qū)紅巖試劑廠;硝酸鋁、亞硝酸鈉:分析純,天津市風船化學試劑廠;蒺藜葉和果實:均來源于陜西省陜北地區(qū),經西安醫(yī)學院張寒教授鑒定。

紫外可見分光光度計:UV-6000T,上海元析儀器有限公司;十萬分之一電子天平:Precise Gravimetrics AG Dietikon,Switzerlang;噴臘打印機:Xerox Phaser8570,美國富士施樂集團;手機:iphone7,蘋果公司;不同規(guī)格移液器:大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司;紙芯片:Whatman No.1,濾紙實驗室自制。

1.2 實驗原理

黃酮類化合物結構中相鄰的羰基與羥基,如5-羥基和4-羰基、3-羥基和4-羰基、4′-羥基和5′-羥基,可與Al3＋在堿性條件下生成紅色絡合物。以蘆丁為對照品,分析待測物質總黃酮的含量[14]。將顯色劑鋪滿紙芯片,再將待測物溶液滴加到紙芯片的中心,兩者在紙芯片上發(fā)生顯色反應,通過手機拍照記錄結果,用PhSp_CS2軟件分析圖片色度值。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

精密移取50μLρ(蘆丁)＝0.294 0 mg/m L標準溶 液 于0.5 m L離心管中,加 入5.0μLw(Na NO2)＝4%溶液,靜置反應6 min,再加入5.0μLw[Al(NO3)3]＝10%溶液;靜置反應6 min。分別精密移取上述標準溶液7.6、7.8、8.0、8.2、8.4μL,依次同4.0μLw(NaOH)＝10%溶液在紙芯片上進行反應,考察蘆丁標準溶液上樣量對顯色結果的影響,見圖1。

由圖1可知,上樣量為7.8μL時,液體可完全鋪滿紙芯片,呈規(guī)則圓形且顯色均勻,上樣量為8.0、8.2和8.4μL時溶液有部分溢出,故選取7.8 μL為最佳蘆丁溶液上樣量。

考察顯色時間對顯色強度的影響,見圖2。

圖1 蘆丁溶液上樣量對顯色強度的影響

圖2 反應時間對顯色強度的影響

由圖2可知,顯色3 min和4 min時所得顏色鋪展不均勻,出現(xiàn)顏色堆積現(xiàn)象從而影響分析結果。

反應時間對顏色強度最大值(PhSp_CS2軟件分析RGB通道即紅、綠、藍三疊加通道m(xù)ean值,簡稱RGB值)的影響見表1。

表1 反應時間對RGB值的影響

由表1可知,顯色2 min時顏色最均勻且RGB值最大,因此選擇顯色2 min。

w(NaOH)、w[Al(NO3)3]和w(Na NO2)均會對顯色強度產生影響,見表2~表4。

表2 w(NaOH)對RGB值的影響

表3 w[AI(NO3)3]對RGB值的影響

表4 w(NaNO2)對RGB值的影響

由表2~表4可知,NaNO2溶液和Al(NO3)3溶液體積為5.0μL、質量分數分別為4%和10%,NaOH體積為4.0μL、質量分數為10%時RGB值最大;NaNO2和NaOH體積分別為5.0μL和4.0μL,質量分數分別為4%和10%,Al(NO3)3體積為5.0μL,質量分數為10%時RGB值最大;NaOH和Al(NO3)3溶液體積分別為4.0μL和5.0μL,質量分數為10%,NaNO2體積為5.0μL,質量分數為4%時RGB值最大。因此選擇w(NaOH)＝10%、w[Al(NO3)3]＝10%,和w(NaNO2)＝4%進行顯色實驗。

2.2 標準曲線的建立

以RGB值對ρ(蘆丁)進行線性擬合見圖3。

圖3 RGB值對ρ(蘆丁)線性擬合

配制ρ(蘆丁)＝0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 0 mg/m L溶液,精密移取50μL至離心管中,加入5.0μLw(NaNO2)＝4%溶液,反應6 min,再加入5.0μLw[Al(NO3)3]＝10%溶液,反應6 min。精密移取4.0μLw(NaOH)＝10%溶液滴于紙芯片中心,待溶液鋪滿紙芯片后,取上述蘆丁溶液7.8μL滴加到紙芯片中心位置,反應2 min后用手機拍照,PhSp_CS2進行分析,得出RGB值。

由圖3可 知,ρ(蘆 丁)＝0.058 80~0.294 0 mg/m L,線性關系良好。

2.3 方法學考察

取用0.176 4 mg/m L蘆丁標準品溶液,按照最佳檢測條件在紙芯片上與Na NO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系反應,手機拍照,用PhSp_CS2軟件分析蘆丁與空白的RGB值,見表5。根據標準工作曲線方程換算檢測濃度,得紙芯片法日內重復性為1.44%(n＝6);以上步驟重復操作6 d,得日間重復性為1.71%;日內和日間重復性結果均小于5%,說明該方法的重復性良好。

表5 紙芯片方法的日內重復性和日間重復性

取用0.235 2 mg/m L蘆丁標準品溶液,按照最佳實驗條件在紙芯片上與NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯 色 體 系 反 應,分 別 于2、4、6、8、10、12 min拍照,得到6組圖像,提取6組圖像的RGB值,根據標準工作曲線方程得到檢測質量濃度,見表6。

表6 紙芯片方法的穩(wěn)定性

由表6可知,紙芯片檢測方法在12 min內保持穩(wěn)定,RSD值為0.76%,穩(wěn)定性良好。

2.4 蒺藜樣品中總黃酮含量測定

蒺藜果實和葉中黃酮提取方法參照文獻[15],取干燥的刺蒺藜果實和葉細粉各3 g,倒入250 m L圓底燒瓶中,加60 m L體積分數80%乙醇,于超聲儀上加熱回流并超聲40 min,抽濾2次,濾液轉移至100 m L容量瓶,用乙醇定容。采用紙芯片法,測得刺蒺藜果實和葉子提取液中ρ(黃酮)＝28.89、109.5μg/m L。在最大吸收波長為506 nm時采用分光光度法測得上述提取液ρ(黃酮)＝28.71、108.7μg/m L。2種方法檢測結果符合較好,相對誤差分別為0.62%和0.76%。

取3份刺蒺藜果實提取液,分別加入蘆丁標準品,進行加標回收實驗,見表7。

由表7可知,提取液的加標回收率分別為97.93%、98.69%、101.75%,均 在95.00%~105.00%,說明紙芯片檢測法加標回收率良好。

表7 紙芯片檢測法的加標回收率結果

3 結 論

作者建立了一種基于紙芯片技術快速檢測黃酮類化合物的新方法。該方法簡便、準確,具有較好的重復性和穩(wěn)定性,無需借助分光光度計等大型儀器,即可對未知樣品中黃酮類化合物含量進行定量檢測,為含有黃酮物質的藥材的質量評價提供了科學依據,在黃酮類化合物的定量檢測方法學領域具有十分良好的發(fā)展前景。