劉 兵， 劉 巖， 李斯琪， 李紅帥， 徐麗斯， 劉艷霞

國家老年疾病臨床研究中心 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)中心 干二科，遼寧 沈陽 110016

神經(jīng)酰胺是細(xì)胞膜的重要組分，是構(gòu)成生物膜的主要磷脂，作為脂質(zhì)第二信使參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起到重要作用；同時(shí)，其也是鞘磷脂信號(hào)途徑的重要中間產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞之間的相互作用、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為代謝小分子的一種，神經(jīng)酰胺在炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。神經(jīng)酰胺還是一種潛在的生物標(biāo)志物，對(duì)預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展及預(yù)后具有臨床應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)酰胺家族成員眾多，但目前的研究中檢測(cè)種類有限。針對(duì)神經(jīng)酰胺的檢測(cè)結(jié)果很少涉及同時(shí)分類檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)幾種神經(jīng)酰胺的含量[6]。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法平臺(tái)建立廣譜的神經(jīng)酰胺檢測(cè)方法，可一次性檢測(cè)多個(gè)神經(jīng)酰胺種類，為全面解析神經(jīng)酰胺在疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 超高效液相色譜儀(美國，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，Waters)；CV100-DNA真空離心濃縮儀(中國，北京吉艾姆)。全譜神經(jīng)酰胺指標(biāo)包含Ceramide 16:0(Cer 16:0)、Ceramide 18:0(Cer 18:0)、Ceramide 24:0(Cer 24:0)、Ceramide 24:1(Cer 24:1)；Cer 16:0-d7、Cer 18:0-d7、Cer 24:0-d7、Cer 24:0-d7為相應(yīng)神經(jīng)酰胺內(nèi)標(biāo)。色譜甲醇(美國，Merck)；色譜乙腈(美國，Merck)；甲酸(中國，阿拉丁)；乙酸銨(中國，麥克林)。

1.2 樣本處理方法 10 μl血漿加入20 μl內(nèi)標(biāo)溶液，再加入570 μl甲醇，渦旋3 min以上，4℃、12 000 r/min離心15 min，取200 μl上清液進(jìn)樣分析。

1.3 色譜條件 選擇兩種色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1×100.0 mm，1.7 μm)進(jìn)行檢測(cè)，其中，BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)色譜柱峰型和峰強(qiáng)度更好。見圖1。柱溫：50℃；進(jìn)樣量：2 μl；流動(dòng)相：5 mM乙酸銨水溶液(A相)～0.1%甲酸乙腈(B相)；梯度洗脫：0～1.0 min 85%～100%B，1.0～3.0 min 100%B，3.0～3.1 min 100%～85%B，3.1～5.0 min 85%B。

圖1 BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)色譜柱定量下限色譜圖

1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：35 V；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：800 L/h；錐孔氣：50 L/h；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。各化合物的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式模式下定量分析神經(jīng)酰胺質(zhì)譜參數(shù)

1.5 性能驗(yàn)證方法

1.5.1 濃度范圍 將8個(gè)濃度水平的4種神經(jīng)酰胺(Cer 16:0、Cer 18:0、Cer 24:0、Cer 24:0)校準(zhǔn)品，按“1.2 樣本處理方法”處理后，測(cè)定濃度并繪制曲線，以校準(zhǔn)品的濃度為自變量x，峰面積比值y為縱坐標(biāo)，求出線性回歸方程，計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r。

1.5.2 精密度和準(zhǔn)確度 在同一天檢測(cè)低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控品，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算不同濃度水平質(zhì)控品的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)和相對(duì)偏差(relative deviation，Dev)作為批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。連續(xù)檢測(cè)3 d，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算不同濃度水平CV和Dev作為批間精密度和準(zhǔn)確度。

1.5.3 回收率和基質(zhì)效應(yīng) 準(zhǔn)確度采用加樣回收試驗(yàn)評(píng)價(jià)，通過向血漿樣品中加入不同濃度(同精密度和準(zhǔn)確度濃度)標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算回收率，評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度?；|(zhì)效應(yīng)是評(píng)價(jià)基質(zhì)對(duì)被測(cè)物的影響，通過向血漿樣品及空白基質(zhì)(甲醇)中加入不同濃度(同精密度和準(zhǔn)確度濃度)標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)6次，按照“1.2 樣本處理方法”處理樣品。神經(jīng)酰胺為內(nèi)源性成分，因此需要扣除空白本底(空白標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算平均值作為空白本底值)，具體回收率(R%)計(jì)算公式如下：R% =(C加標(biāo)檢測(cè)值-C空白本底值)/C加標(biāo)量×100%，要求各濃度回收率在85%～115%，低濃度點(diǎn)在80%～120%，CV<15%。具體基質(zhì)效應(yīng)(M%)計(jì)算公式如下：M% =(C血漿加標(biāo)檢測(cè)值-C空白本底值)/C空白基質(zhì)加標(biāo)量×100%。如果同一濃度，含基質(zhì)的樣本測(cè)定值/不含基質(zhì)樣本測(cè)定值在85%～115%則認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)，如果低于85%則認(rèn)為基質(zhì)對(duì)被測(cè)物有抑制作用，相反，如果高于115%則認(rèn)為基質(zhì)對(duì)被測(cè)物有增強(qiáng)作用。

1.5.4 殘留率 通過檢測(cè)高值質(zhì)控品標(biāo)本檢測(cè)后空白標(biāo)本，連續(xù)反復(fù)6次，以空白標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)殘留情況。要求高值質(zhì)控品后的空白標(biāo)本的測(cè)定值≤定量下限的20%，如果殘留不可避免，可在高值質(zhì)控品標(biāo)本后增加空白溶劑，以確保不響應(yīng)準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4種神經(jīng)酰胺的相關(guān)系數(shù)r值均大于0.99，呈良好線性關(guān)系，且具有很寬的線性范圍，Cer 16:0、Cer 18:0在10.0～2 000.0 ng/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，Cer 24:0、Cer 24:1在0.1～20.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 精密度、準(zhǔn)確度及回收率、基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4種神經(jīng)酰胺的3個(gè)濃度質(zhì)控品的批內(nèi)和批間CV≤15%、Dev≤±15%，檢驗(yàn)結(jié)果均滿足性能驗(yàn)證要求，說明該方法精密度和準(zhǔn)確度良好。各濃度平均回收率均在92.20%～111.58%之間，說明該方法準(zhǔn)確度較好。各濃度基質(zhì)效應(yīng)在92.69%～98.90%之間，說明基質(zhì)對(duì)被測(cè)物無影響，滿足實(shí)驗(yàn)要求。見表2。

表2 精密度、準(zhǔn)確度及回收率、基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 殘留實(shí)驗(yàn)結(jié)果 高值質(zhì)控品后的空白標(biāo)本的測(cè)定值均≤定量下限的20%，殘留較少，滿足實(shí)驗(yàn)要求。見表3。

表3 殘留實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

血漿中神經(jīng)酰胺水平是預(yù)測(cè)心血管事件的重要因子，既往研究證實(shí)，神經(jīng)酰胺可作為多種類型疾病的潛在生物標(biāo)志物[7]。建立一個(gè)神經(jīng)酰胺的檢測(cè)平臺(tái)對(duì)多種疾病的研究都具有重大意義，有助于提高對(duì)疾病診斷、分型及預(yù)后評(píng)估的能力。在基于冠心病患者的研究中，神經(jīng)酰胺亞型(Cer 16:0、Cer 18:0、Cer 22:0、Cer 24:0、Cer 24:1)被發(fā)現(xiàn)與斑塊不穩(wěn)定[8]、不良心血管事件[9]及遠(yuǎn)期預(yù)后[10]相關(guān)。

目前，神經(jīng)酰胺的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、 高效液相色譜法、質(zhì)譜法及高效液相色譜法—質(zhì)譜法等。其中，高效液相色譜法是分離神經(jīng)酰胺的主要技術(shù)，但其前期處理復(fù)雜，耗時(shí)長，存在靈敏度和分辨率不高的缺陷，增加了實(shí)驗(yàn)的難度和誤差。而質(zhì)譜法雖然靈敏度高、所需樣品少，且用時(shí)較短，但由于可能出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)重疊的脂質(zhì)分子之間的相互干擾，常導(dǎo)致檢測(cè)特異性不佳[11-13]。本研究研發(fā)了一種基于美國Waters超高效液相色譜儀和ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜儀系統(tǒng)的聯(lián)機(jī)檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)Cer 16:0、Cer 18:0、Cer 24:0、Cer 24:1這4種神經(jīng)酰胺的含量。為了選擇合適的色譜柱，本研究選擇了兩種色譜柱進(jìn)行檢測(cè)和質(zhì)譜等條件的優(yōu)化，BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)色譜柱峰型和峰強(qiáng)度更好，最終選定的色譜條件為以BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)為分析色譜柱，柱溫50℃，流動(dòng)相A為5 mM乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫。采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：35 V；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：800 L/h；錐孔氣：50 L/h。掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、殘留實(shí)驗(yàn)等參數(shù)進(jìn)行性能評(píng)估，結(jié)果顯示，本研究方法的準(zhǔn)確度和精密度均不劣于既往研究[14]，且每個(gè)樣品分析僅需20 min左右，與邱麗萍等[15]研究結(jié)果比較，具有較高的分析效率，適用于大批量樣品的定量分析。

本研究結(jié)果顯示：4種神經(jīng)酰胺的相關(guān)系數(shù)r值均大于0.99，呈良好線性關(guān)系，且具有很寬的線性范圍，Cer 16:0、Cer 18:0在10.0～2 000.0 ng/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，Cer 24:0、Cer 24:1在0.1～20.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；4種神經(jīng)酰胺的3個(gè)濃度質(zhì)控品的CV≤15%、Dev≤±15%，優(yōu)于可接受范圍(±20%)，說明該方法精密度和準(zhǔn)確度良好；平均回收率均在92.20%～111.58%之間，基質(zhì)效應(yīng)在92.69%～98.90%之間，說明該方法準(zhǔn)確度較好，受基質(zhì)影響?。桓咧蒂|(zhì)控品后的空白標(biāo)本的測(cè)定值均≤定量下限的20%，殘留較少，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

綜上所述，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定不同類型神經(jīng)酰胺的方法精密度和準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可作為檢測(cè)血清中不同類型神經(jīng)酰胺含量的工具。