楊筱萌，羅語(yǔ)思，張科

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科

1972 年 Kerr 等[1]首次提出了細(xì)胞凋亡（apoptosis）的概念，宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡探索的真正開始。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），是多細(xì)胞生物的一種生理性細(xì)胞死亡，是在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中為維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和調(diào)控機(jī)體發(fā)育，由基因編碼的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，貫穿于機(jī)體整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程，可由細(xì)胞內(nèi)部和外部因素刺激所調(diào)控，可自然發(fā)生也可由病原微生物感染等外界因素誘導(dǎo)發(fā)生。

機(jī)體正常細(xì)胞凋亡存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，由多種凋亡誘導(dǎo)或凋亡抑制分子協(xié)同作用，分為內(nèi)始式途徑（intrinsic apoptosis pathway）和外始式途徑（extrinsic apoptosis pathway）[2]。內(nèi)始式途徑即線粒體凋亡途徑，主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)在信號(hào)傳導(dǎo)，引起線粒體跨膜電位去極化，導(dǎo)致促凋亡蛋白從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。線粒體凋亡途徑主要由B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）蛋白家族成員控制和調(diào)節(jié)。BCL-2 在細(xì)胞線粒體膜上表達(dá)，是一種明確的細(xì)胞存活促進(jìn)整合膜蛋白。通過(guò)與B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病x1 細(xì)胞（B cell lymphoma/leukemia-x1, Bcl-x1）結(jié)合，BCL-2 可抑制Caspase-9 活性從而抑制細(xì)胞色素C（cyto-chrome C,Cyt C）從線粒體釋放到胞質(zhì)，而Cyt C 進(jìn)入胞質(zhì)與Apaf-1 及Caspase-9 前體形成凋亡小體是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[3]。BCL-2 不僅可通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜通透性抑制宿主細(xì)胞凋亡，也可通過(guò)改變細(xì)胞線粒體膜通透性調(diào)節(jié)線粒體中Cyt C 的釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該過(guò)程包括鈣離子過(guò)度進(jìn)入、線粒體谷胱甘肽的氧化和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的增加等導(dǎo)致線粒體膜通道孔持續(xù)開放，造成線粒體膜電位的消失和Cyt C 的釋放。BCL-2 蛋白家族成員Puma 通過(guò)上調(diào)促凋亡因子Bax表達(dá)引起線粒體膜電位下降，Cyt C 釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡；另一成員佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯誘導(dǎo)蛋白 1（phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1,PMAIP 1）可引起Caspase-9 活化促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。外始式途徑是通過(guò)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族（如CD95）的受體與配體結(jié)合開始的，這些配體有TNF、由T細(xì)胞分泌的Fas 配體（Fas Ligand, FasL)等。在 Fas 偶聯(lián)死亡區(qū)域蛋白（fas-associated death domain protein, FADD）的協(xié)助下，受體不斷在細(xì)胞質(zhì)中收集半胱天冬酶原8（procaspase-8）。自身激活的 Caspase-8 將會(huì)引發(fā)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]。因此，可將BCL-2 的表達(dá)下調(diào)、Cyt C 的釋放以及 Caspase-9 的激活作為內(nèi)始式途徑發(fā)生的標(biāo)志性事件加以檢測(cè)，而將Caspase-8 的激活作為外始式途徑發(fā)生的標(biāo)志性事件加以檢測(cè)，從而確定細(xì)胞凋亡由哪一種途徑主導(dǎo)[7]。

病毒是一類體積非常微小、結(jié)構(gòu)極其簡(jiǎn)單、性質(zhì)十分特殊的微生命體，以其簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)、特殊的增殖方式和絕對(duì)的細(xì)胞內(nèi)寄生等特征顯著區(qū)別于其他生命體[8]。在細(xì)胞外，病毒以具有感染性的病毒粒子存在，但既不生長(zhǎng)，也不能以分裂方式進(jìn)行繁殖；在細(xì)胞內(nèi)，病毒具有繁殖性，利用宿主細(xì)胞的生物合成機(jī)制，合成子代病毒基因組和病毒蛋白，裝配子代病毒并釋放至胞外[9]。越來(lái)越多資料表明，病毒感染與細(xì)胞凋亡密切關(guān)聯(lián)[10-12]。病毒感染宿主細(xì)胞后，一方面宿主細(xì)胞可利用細(xì)胞凋亡來(lái)清除被病毒感染的細(xì)胞，加速感染細(xì)胞的死亡，繼而限制病毒復(fù)制和傳播，受病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡可由病毒特異性的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介導(dǎo)，也可在無(wú)外界信號(hào)刺激情況下自發(fā)產(chǎn)生，是機(jī)體針對(duì)病毒入侵而采取的防御機(jī)制之一；另一方面，為了復(fù)制遺傳物質(zhì)和生成子代病毒，某些病毒可通過(guò)抑制宿主細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)和相應(yīng)蛋白的合成，遲滯被感染細(xì)胞細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使病毒順利完成復(fù)制周期，從而產(chǎn)生大量子代病毒，這將有助于子代病毒傳播，是病毒針對(duì)宿主細(xì)胞胞內(nèi)微環(huán)境而進(jìn)化出的生存機(jī)制之一。

病毒可通過(guò)直接或間接的方式影響細(xì)胞凋亡，達(dá)到其繁殖和擴(kuò)散的目的，而病毒感染細(xì)胞后是誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡，取決于多方面因素。本綜述主要聚焦于病毒感染與細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系，從細(xì)胞程序性死亡角度探討病毒感染性疾病的發(fā)病機(jī)制，以期為深入研究病毒侵染和致病機(jī)理提供更多信息。

1 病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

病毒感染細(xì)胞后，引起靶細(xì)胞凋亡主要有兩種形式：①通過(guò)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)；②通過(guò)病毒自身蛋白直接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，或病毒編碼的產(chǎn)物能誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá)等方式間接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[13]。見圖1。

圖1 病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的三種方式

病毒感染細(xì)胞后，靜息狀態(tài)的CTL 被抗原提呈細(xì)胞所激活，擴(kuò)增分化為效應(yīng)細(xì)胞，監(jiān)視機(jī)體并清除感染。CTL 主要通過(guò)兩種效應(yīng)機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]，以此清除受病毒感染的細(xì)胞。一是通過(guò)分泌穿孔素（perforin），與細(xì)胞膜結(jié)合并在細(xì)胞膜上“鉆孔”。為實(shí)現(xiàn)“鉆孔”，CTL的T細(xì)胞受體首先必須能識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞，然后CTL 上的黏附分子將靶細(xì)胞緊緊地固定住，隨后CTL 將穿孔素和一種稱為顆粒酶B（granzyme B, GrB）的混合物輸送到靶細(xì)胞表面。穿孔素可破壞靶細(xì)胞的外膜，當(dāng)靶細(xì)胞試圖修復(fù)這種損傷時(shí)，GrB 和穿孔素就可通過(guò)由靶細(xì)胞膜制成的囊泡進(jìn)入細(xì)胞。被囊泡包裹進(jìn)入靶細(xì)胞后，穿孔素分子即可在囊泡膜上鑿孔，使GrB 被釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，GrB 可觸發(fā)酶鏈反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。二是由CTL大量表達(dá)FasL，F(xiàn)asL與靶細(xì)胞受體Fas結(jié)合，啟動(dòng)靶細(xì)胞死亡受體-配體凋亡途徑，導(dǎo)致攜帶Fas 的靶細(xì)胞凋亡。通過(guò)以上兩種機(jī)制，機(jī)體在誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞凋亡的同時(shí)，清除入侵的病毒。早期有學(xué)者對(duì)呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）感染致細(xì)支氣管炎患兒的鼻咽抽吸物和外周血的中性粒細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究[15]，通過(guò)流式細(xì)胞儀聯(lián)合Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗CD95（Fas）單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，RSV 感染組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明RSV 感染或可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞通過(guò)Fas/FasL 途徑加速凋亡，從而干擾機(jī)體免疫。O'donnell 等[16]發(fā)現(xiàn) RSV 感染 A549 細(xì)胞后，可激活Fas 啟動(dòng)子，促進(jìn)Fas 基因表達(dá)上調(diào)，致使細(xì)胞表面的Fas 表達(dá)升高，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。Nichols 等[17]在探討甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）感染導(dǎo)致白細(xì)胞減少癥的可能機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，感染IAV 后淋巴細(xì)胞亞群中的CD4+、CD8+和CD19+淋巴細(xì)胞均發(fā)生細(xì)胞凋亡，且在凋亡細(xì)胞表面呈現(xiàn)Fas 高表達(dá)，非凋亡細(xì)胞表面則為Fas 低表達(dá)，并且在感染后細(xì)胞中加入 FasL 抗體、Ac-DEVD-CHO（caspase-3 抑制劑）或Z-VAD-FMK（一般caspase 抑制劑）后，細(xì)胞凋亡明顯減少，說(shuō)明Fas-FasL 信號(hào)通路在IAV 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡中起重要作用。同時(shí)，有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）[18-19]、猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）也可通過(guò)Fas/FasL 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。SARS 患者外周血中淋巴細(xì)胞明顯減少，特別是T 淋巴細(xì)胞，這也與T 細(xì)胞表面 Fas 高表達(dá)相關(guān)[18-19，21]。有學(xué)者用 IAV 經(jīng)鼻感染穿孔素基因敲除小鼠后發(fā)現(xiàn)，穿孔素基因缺乏導(dǎo)致流感病毒在小鼠肺內(nèi)大量增殖，小鼠清除病毒感染細(xì)胞所需的時(shí)間延長(zhǎng)，并且病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)間亦因穿孔素的缺乏而延遲，說(shuō)明此株病毒依賴穿孔素促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并以此控制了病毒的增殖[22]。

病毒可通過(guò)蛋白表達(dá)直接促進(jìn)靶細(xì)胞凋亡。有研究表明人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）侵襲后，CD4+T 淋巴細(xì)胞的不斷減少與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)[23]。HIV 包膜蛋白gp120與CD4+T 淋巴細(xì)胞表面的CD4 分子結(jié)合，促進(jìn)HIV進(jìn)入細(xì)胞，gp120 從病毒膜上脫落并大量積聚在淋巴組織中，通過(guò)CD4 分子活化信號(hào)途徑誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致該細(xì)胞減少，引起以CD4+T淋巴細(xì)胞缺損和功能障礙為中心的嚴(yán)重免疫缺陷[24]。HIV 的病毒蛋白 R（viral protein regulatory,Vpr）[25]、鼠細(xì)小病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白 1（non-structural protein 1, NS1）[26]均可造成細(xì)胞周期 G2 期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HBV X 蛋白（hepatitis B virus X protein,HBVX）是由HBVX基因編碼的一種多功能蛋白，它同樣能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]，如HBV X 蛋白促進(jìn)IL-18 mRNA 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Fas/FasL 的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]，還可激活線粒體/Cyt C 凋亡途徑[29]。SARS 病毒M 蛋白通過(guò)上調(diào)鈣濃度而增加線粒體膜通透性，當(dāng)線粒體外膜被損壞后，位于線粒體內(nèi)膜上的凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor,AIF）被鈣依賴性鈣蛋白酶裂解釋放到胞質(zhì)，進(jìn)入胞核中，裂解激活的AIF 具有切割DNA 的功能，使細(xì)胞DNA片段化，促使細(xì)胞凋亡[30-33]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4 和Nsp10 通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡[34]。早期有研究表明，SARS-CoV Spike 蛋白及其主要片段S318-510 可以在早期通過(guò)抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）1/2 信號(hào)通路誘導(dǎo)非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero-E6 細(xì)胞）的凋亡[35]。席卷全球的SARS-CoV-2 ORF3a 蛋白可通過(guò)級(jí)聯(lián)激活的Caspase-8 裂解Bid 蛋白，使之形成截?cái)嘈偷膖Bid 進(jìn)入線粒體促進(jìn)Cyt C 釋放，誘導(dǎo)Vero 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡[36]。也有研究表明SARS-CoV-2 通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[37]。

病毒還可通過(guò)編碼產(chǎn)物誘導(dǎo)凋亡基因表達(dá)間接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。Takeuchi 等[38]研究呼吸道合胞病毒對(duì)正常新生兒?jiǎn)魏思?xì)胞白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，RSV Long 毒株感染A549 細(xì)胞4 小時(shí)后，即可引起細(xì)胞中促凋亡基因感染素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory facto 1, IRF-1）基因表達(dá)的上調(diào)。Hsu 等[39]報(bào)道在人細(xì)小病毒B19 感染的紅細(xì)胞中，NS1 通過(guò)招募細(xì)胞線粒體死亡蛋白Bax 和Bad，上調(diào)caspase-3和caspase-9蛋白活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53 是人體抑癌基因，其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，積累時(shí)可阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，維持基因組穩(wěn)定，如腺病毒（adenovirus,AV）的E1A 蛋白能提高細(xì)胞中p53 水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[40]。不過(guò)也有研究表明AV 的E1A 蛋白有抑制細(xì)胞凋亡作用[41]。Devireddy 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，牛單純皰疹病毒Ⅰ型感染外周血單核細(xì)胞后p53 數(shù)量和活性明顯增高。袁鈞瑛等[43]首次發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶NSP12（冠狀病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制的高度保守的核心成分）促進(jìn)了受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1）的激活，而RIPK1的激活可以通過(guò)介導(dǎo)caspase-8的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并推測(cè)抑制RIPK1 可能為治療重癥COVID-19提供一種治療選擇。

2 病毒感染抑制細(xì)胞凋亡

在長(zhǎng)期進(jìn)化后，一些病毒為在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存，可通過(guò)多種途徑干擾機(jī)體介導(dǎo)感染的細(xì)胞凋亡作用，并有利于其自身在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏。不同病毒抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制不同。病毒可以促進(jìn)宿主細(xì)胞編碼抑凋亡蛋白以阻斷凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者通過(guò)啟動(dòng)宿主的抗凋亡機(jī)制阻止或者延遲病毒感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道B3 型柯薩奇病毒感染細(xì)胞后可激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，啟動(dòng)核糖體合成蛋白，促進(jìn)病毒復(fù)制，同時(shí)激活NF-κB 通路，提高宿主細(xì)胞存活率，顯著抑制Caspase-9 活化和Caspase-3 的自我裂解，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，為病毒復(fù)制和子代病毒釋放提供更多載體[44]。Domachowske等[45]報(bào)道RSV可上調(diào)抗凋亡基因直接早應(yīng)答因子3（immediate early response 3, IEX-1L）的表達(dá)從而抑制由 TNF-α 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，HEp-2細(xì)胞感染RSV-B毒株后，表現(xiàn)為HEp-2 細(xì) 胞 IEX-1L 基 因 表 達(dá) 上 調(diào) ，RNA 印 記 法（Northern blot）顯示細(xì)胞內(nèi)IEX-1L 基因水平上升至7 倍。Kotelkin 等[46]還發(fā)現(xiàn) RSV 可依賴抗凋亡基因Mcl-1 表達(dá)的上調(diào)，延遲被感染細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。IEX-1L 和Mcl-1 與抗細(xì)胞凋亡蛋白BCL-2 同源，均具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。還有一些病毒可通過(guò)加強(qiáng)宿主細(xì)胞BCL-2表達(dá)或自身表達(dá)出BCL-2同型異構(gòu)體抑制細(xì)胞凋亡，如EB 病毒編碼的BARF-1 蛋白[47-48]、腺病毒編碼的 E1B-19k 蛋白[49]等均是BCL-2 的同型異構(gòu)體。并且E1B-19K 不僅具有與BCL-2 相同的抗凋亡機(jī)制，還可與兩種重要的促凋亡因子Bax 和Bak 結(jié)合以及阻止Cyt C 自線粒體 釋 放[50-51]。Karl 等[52]實(shí)驗(yàn)證實(shí)以 PI3K 抑 制 劑LY294002 預(yù)處理的RSV 感染組細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯高于LY294002 預(yù)處理對(duì)照組、空白對(duì)照組和RSV 感染組，凋亡發(fā)生率分別為19.86%、2.93%、0.08%和0.37%。故認(rèn)為RSV 感染可抑制宿主細(xì)胞凋亡的提前發(fā)生，是通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)路徑所致。另上文中提到的HBV X蛋白，可通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，如以p53 基因非依賴性調(diào)控[53]、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[54]以及Caspase-3活性抑制[55]等。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，同一科病毒的不同分離株或者是同一株病毒感染不同細(xì)胞系，對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的影響都可能有所差異，這表明病毒感染細(xì)胞后對(duì)凋亡過(guò)程的調(diào)控具有特異性和復(fù)雜性。病毒對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控并不是絕對(duì)誘導(dǎo)或絕對(duì)抑制，而是在不同感染時(shí)間段精準(zhǔn)有序的調(diào)控，抑制細(xì)胞凋亡可為病毒復(fù)制和子代病毒釋放提供更多載體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可及時(shí)引導(dǎo)巨量子代病毒釋放。因此，從大多數(shù)病毒感染進(jìn)程看，細(xì)胞凋亡可能遵循“先抑后揚(yáng)”的規(guī)律。細(xì)胞凋亡是病毒與宿主共同作用的一種復(fù)雜的過(guò)程，病毒感染引起宿主細(xì)胞的凋亡對(duì)病毒的復(fù)制有消極或積極的影響。就宿主細(xì)胞而言，宿主會(huì)進(jìn)化出識(shí)別病毒感染機(jī)制，當(dāng)宿主細(xì)胞受到外界刺激，為了應(yīng)對(duì)這種刺激而發(fā)生凋亡以清除感染，即宿主細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)性凋亡抑制病毒復(fù)制。就病毒而言，一方面病毒可以利用細(xì)胞凋亡釋放和傳播子代病毒粒子[26]，也可以利用凋亡過(guò)程中激活的Caspase 來(lái)促進(jìn)自身繁殖，病毒會(huì)利用Caspase 促進(jìn)病毒成分的核質(zhì)轉(zhuǎn)移，幫助病毒編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄和修飾，或者幫助病毒粒子的成熟組裝[57]；另一方面病毒為了自身的繁殖也會(huì)抑制宿主細(xì)胞凋亡[56-57]。有關(guān)病毒對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)指導(dǎo)臨床的抗病毒措施有重要意義，同時(shí)對(duì)于探索細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)分子機(jī)制亦具有深遠(yuǎn)影響。