陳曉燕 陽(yáng)莉 蔡惠寧 李翠平 盧建溪

自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK cell）是具有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性殺傷特點(diǎn)的先天性免疫細(xì)胞，是人體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線［1-2］。NK 細(xì)胞活化后通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒功能發(fā)揮自然殺傷功能［3］，NK細(xì)胞還有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染和免疫過(guò)程都起著重要作用［4］。NK細(xì)胞對(duì)細(xì)胞免疫治療效果具有重要意義，而評(píng)估NK 細(xì)胞活性的主要方法是通過(guò)檢測(cè)外周血或體外誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)NK 細(xì)胞的殺傷功能［5-6］。

本研究采用流式細(xì)胞檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用CFSE與Annexin-V/7-AAD 三色熒光染色法和CFSE 與PI 雙色熒光染色法檢測(cè)不同效靶比以及不同孵育時(shí)間的NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷功能。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

K562 白血病細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存；所有外周血樣本取自2019 年至2021 年中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院健康志愿者，癌癥腫瘤患者排除納入，共計(jì)20 名，平均年齡（59±8）歲，本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

ALYS505NK-AC 培養(yǎng)液和ALYS505NK-EX培養(yǎng)液購(gòu)自日本CSTI 公司，RPMI1640 培養(yǎng)液和胎牛血清FBS 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，DMSO 購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司，赫賽汀購(gòu)自美國(guó)Roche 公司，rhIL-2 重組人白細(xì)胞介素-2 購(gòu)自山東泉港藥業(yè)，淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3 購(gòu)自美國(guó)Bechman Coulter 公司，CFSE 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，PE-Annexin-V/7-AAD 熒光凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自孟加拉國(guó)BD 公司，PI 溶液購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司，PBS 緩沖液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Centrifuge 5702R 離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，Sorvall ST16R Centrifuge 離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司，CU600 型電熱恒溫水箱購(gòu)自中國(guó)Bluepard，二氧化碳培養(yǎng)箱240i 購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司，CytoFLEX 流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)Bechman Coulter 公司。

1.3 方法

NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷檢測(cè)分2 組，分別采用2 種不同染色方法，A 組：CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色熒光染色；B 組：CFSE/PI 雙色熒光染色。

1.3.1 效應(yīng)細(xì)胞（NK 細(xì)胞）的準(zhǔn)備

肝素鈉抗凝管采集的外周血，通過(guò)密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用ALYS505NK-AC 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（1～3）×106/mL，加入預(yù)先用赫賽汀包被好的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3 d 用ALYS505NK-EX 培養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)液。收集培養(yǎng)14 d的細(xì)胞，使用淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3 在流式細(xì)胞儀上測(cè)定NK 細(xì)胞（CD3-CD56+）含量，用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL、2×106/mL。

1.3.2 靶細(xì)胞（K562 細(xì)胞）的準(zhǔn)備

K562 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液。收集生長(zhǎng)狀況良好的K562 細(xì)胞，用PBS 緩沖液洗滌兩次，用含0.1%FBS 的PBS 重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞分為A 組和B 組，每組準(zhǔn)備4 管細(xì)胞，每管細(xì)胞的細(xì)胞濃度均為1×106/mL。在A 組和B 組的每管細(xì)胞中分別加入熒光染料CFSE 對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，37℃避光，水浴20 min；加入5 倍體積預(yù)冷的含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基，冰浴5 min，終止反應(yīng)；PBS 洗滌兩次，用含10%FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。

1.3.3 效-靶細(xì)胞共培養(yǎng)

效應(yīng)細(xì)胞按照細(xì)胞數(shù)2×106/mL、1×106/mL，與標(biāo)記好的靶細(xì)胞按照效靶比10∶1、20∶1 分別加入24 孔無(wú)菌培養(yǎng)板中，每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照孔只加靶細(xì)胞，用于檢測(cè)靶細(xì)胞自發(fā)死亡率。將細(xì)胞培養(yǎng)板中的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞輕輕混勻，室溫，1 600 r/min，離心3 min（離心半徑13.9 cm），以使細(xì)胞緊密接觸。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.3.4 使用熒光凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷功能

分別取1 h、2 h、3 h、4 h 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的共培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中，用PBS 緩沖液洗滌兩次后重懸細(xì)胞。A 組細(xì)胞加入Annexin-V 和7-AAD 各5 μL 標(biāo)記細(xì)胞，B 組細(xì)胞加入PI 5 μL 標(biāo)記細(xì)胞，混勻，室溫避光孵育15 min。加入500 μL 緩沖液，室溫，2 200 r/min，離心3 min（離心半徑13.9 cm），洗滌1 次后，加入200 μL 緩沖液重懸。用CytoFLEX 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，CytExpert 獲取和分析數(shù)據(jù)。

計(jì)算公式：靶細(xì)胞殺傷率（%）=（靶細(xì)胞死亡率-靶細(xì)胞自發(fā)死亡率）/（100-靶細(xì)胞自發(fā)死亡率）×100%

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel、Prism 6 和IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；計(jì)量資料采用（±s）表示，使用Shapiro-Wilk 方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)，用Levene's 方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差是否有差異，對(duì)總體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素方差分析，使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的兩兩比較；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

初始培養(yǎng)時(shí)NK 細(xì)胞占PBMC 的比例僅為（6.15±7.29）%，培養(yǎng)到第14 天，NK 細(xì)胞比例增至（48.83±27.28）%。

2.2 CFSE 標(biāo)記靶細(xì)胞結(jié)果

CFSE 均能對(duì)密度為1×107/mL 的靶細(xì)胞進(jìn)行有效標(biāo)記，對(duì)靶細(xì)胞的標(biāo)記率均可達(dá)99%以上。見圖1。

圖1 靶細(xì)胞經(jīng)CFSE 標(biāo)記前后熒光強(qiáng)度變化Figure 1 Changes of fluorescence intensity of target cells labeled with CFSE

2.3 NK 細(xì)胞（CD3-CD56+）對(duì)靶細(xì)胞（K562）的殺傷功能

CFSE/PI 雙色法圈定目的細(xì)胞，分出CFSE陽(yáng)性的細(xì)胞（圖2 中直方圖P2），在門P2 中分析凋亡細(xì)胞（圖2 中直方圖Q2）。在CFSE+細(xì)胞群中，CFSE+PI-為正常靶細(xì)胞，CFSE+PI+為發(fā)生凋亡的靶細(xì)胞。NK 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷功能越強(qiáng)，靶細(xì)胞凋亡值越大，從圖2 可知，隨著效靶比由10∶1 增加為20∶1，NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能越強(qiáng)；隨著共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能越強(qiáng)。

圖2 CFSE/PI 雙色法檢測(cè)NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷功能Figure 2 CFSE/PI to detect the killing function of NK cells on K562 cells

CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色法圈定目的細(xì)胞，分出CFSE 陽(yáng)性的細(xì)胞（圖3 中直方圖P2），在P2 中分析早期凋亡和中晚期凋亡細(xì)胞（圖3 中十字門散點(diǎn)圖）。CFSE 可有效地將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞區(qū)分開，CFSE+為靶細(xì)胞，在CFSE+細(xì)胞群中，Annexin-V 和7-AAD 雙標(biāo)記將靶細(xì)胞分為Annexin-V-7-AAD-、Annexin-V-7-AAD+、Annexin-V+7-AAD+、Annexin-V+7-AAD-4 個(gè)組群，其中CFSE+Annexin-V-7-AAD-為正常靶細(xì)胞、CFSE+Annexin-V+7-AAD-為早期凋亡的靶細(xì)胞，CFSE+Annexin-V+7-AAD+為中晚期凋亡的靶細(xì)胞。NK 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷功能越強(qiáng)，靶細(xì)胞凋亡值越大，從圖3 可知，隨著效靶比由10∶1 增加為20∶1，NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能越強(qiáng)；隨著共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能越強(qiáng)。

圖3 CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色法檢測(cè)NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用Figure 3 CFSE/Annexin-V/7-AAD to detect the killing function of NK cells on K562 cells

NK 細(xì)胞對(duì)K562 白血病細(xì)胞株的殺傷結(jié)果顯示：檢測(cè)方法的差異性不受效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間影響，交互作用不明顯（F=0.039，P=0.990），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組，效靶比為10∶1、20∶1 時(shí)，NK 細(xì)胞殺傷功能（%）兩兩比較，三色法NK 細(xì)胞殺傷功能顯著高于雙色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，效靶細(xì)胞共培養(yǎng)4 h 時(shí)NK 細(xì)胞殺傷功能最強(qiáng)；在不同效靶比實(shí)驗(yàn)組，兩種染色方法都檢測(cè)出在效靶比20∶1 時(shí)，NK 殺傷功能顯著高于效靶比10∶1。見圖4。

表1 兩種染色方法檢測(cè)NK 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞在不同效靶比及不同時(shí)間組的殺傷效果的三因素方差分析Table 1 Three-way ANOVA of two staining methods were used to detect the killing effect of NK cells on target cells in different effect target ratio and different time groups

表2 兩種染色方法檢測(cè)NK 細(xì)胞在20∶1 和10∶1 效靶比下對(duì)靶細(xì)胞的殺傷功能（n=20，±s）Table 2 The killing function of NK cells to target cells was detected by two staining methods at 20∶1 and 10∶1 target ratios（n=20，±s）

表2 兩種染色方法檢測(cè)NK 細(xì)胞在20∶1 和10∶1 效靶比下對(duì)靶細(xì)胞的殺傷功能（n=20，±s）Table 2 The killing function of NK cells to target cells was detected by two staining methods at 20∶1 and 10∶1 target ratios（n=20，±s）

注：與CFSE/PI 染色方法效靶比為10∶1 組比較，aP＜0.05；與CFSE/PI 染色方法效靶比為20∶1 組比較，bP＜0.05。

染色方法時(shí)間組（h）效靶比10∶1 20∶1 10∶1 20∶1 3 2 4 CFSE/PI CFSE/Annexin-V/7-AAD F 值P 值1 31.71±12.89 36.53±14.39 53.53±28.84a 57.15±29.52b 27.577＜0.001 34.88±11.10 39.76±13.20 59.08±25.62a 63.07±26.82b 30.647＜0.001 41.50±11.34 47.72±14.13 63.41±25.30a 67.21±25.62b 30.647＜0.001 44.79±13.28 53.93±12.35 66.74±21.64a 71.01±23.98b 13.914＜0.001

3 討論

近年來(lái)，活化的NK 細(xì)胞的調(diào)節(jié)免疫功能和細(xì)胞殺傷作用已成為免疫治療研究的熱點(diǎn)［7-8］。有研究表明，腫瘤患者外周血中NK 細(xì)胞活性隨著臨床分期升高呈負(fù)相關(guān)，因此，NK 細(xì)胞活性的檢測(cè)對(duì)評(píng)估腫瘤患者病程和預(yù)后都具有重要的指導(dǎo)意義［9］。

目前檢測(cè)免疫細(xì)胞細(xì)胞毒活性常用的方法主要有同位素標(biāo)記法、酶反應(yīng)比色法和流式細(xì)胞技術(shù)三大類，而流式細(xì)胞術(shù)廣泛用于免疫學(xué)研究，在單細(xì)胞水平上監(jiān)測(cè)細(xì)胞信號(hào)變化，較其他方法更為準(zhǔn)確［10］。研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合示蹤熒光染料CFSE 對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，在單細(xì)胞水平上根據(jù)CFSE 具有很高的熒光活性和穩(wěn)定性，有效地將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞區(qū)分開，檢測(cè)結(jié)果不受效應(yīng)細(xì)胞的影響［11-12］。

本研究通過(guò)比較CFSE/PI 兩色法和CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色法兩種熒光標(biāo)記染色方法，檢測(cè)在不同效靶比、不同共培養(yǎng)時(shí)間的NK 細(xì)胞殺傷功能，結(jié)果顯示三色法更為靈敏。此外，CFSE/PI 兩色法的優(yōu)點(diǎn)是單染色法，上流式調(diào)節(jié)補(bǔ)償更為簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)是雖然能特異性地檢測(cè)靶細(xì)胞的凋亡，但檢測(cè)不到早期凋亡的靶細(xì)胞。CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色方法不但能檢測(cè)出中晚期凋亡細(xì)胞，還能檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。其原理是Annexin-V 是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)，Annexin-V/7-AAD 能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的膜磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異性結(jié)合，可以檢測(cè)出靶細(xì)胞中早期和中晚期凋亡的情況，從而計(jì)算出效應(yīng)細(xì)胞的殺傷功能［13-15］。若對(duì)靶細(xì)胞凋亡需要進(jìn)一步分析，三色法較兩色法更優(yōu)。

綜上所述，兩種染色方法均能對(duì)不同的靶細(xì)胞進(jìn)行有效標(biāo)記，均能檢測(cè)NK 細(xì)胞殺傷功能。但由于CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色方法早、中晚期凋亡細(xì)胞都能區(qū)分開來(lái)，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色方法較CFSE/PI兩色法能更直觀呈現(xiàn)靶細(xì)胞凋亡狀態(tài)，且重復(fù)性好、靈敏度高。