朱禮，吳海智，周叢，袁列江，徐正華，王淑霞，薛敏敏，陳蘭煊，魏湘

（1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，長沙 410007；2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣州 510000）

0 引言

乳作為人類健康膳食的主要營養(yǎng)來源，被認(rèn)為是日常膳食中最天然、最有營養(yǎng)的食物之一[1]，由于乳制品含有蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等對人體很有利的營養(yǎng)素，故作為多個國家居民膳食指南的重要推薦食品之一。羊乳因其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值而為多數(shù)消費(fèi)者青睞[2]。近年來羊乳在國外應(yīng)用廣泛，我國的羊乳市場也在迅速上升，而由于羊乳的泌乳期因受季節(jié)氣候波動和動物間個體差異等因素影響較大，使得產(chǎn)奶量不如牛乳，故價格高于牛乳，鮮羊乳在歐洲的零售價約是牛乳的7倍之高[3]，在我國則約是牛乳的4倍左右，故商家為降低成本，會在羊乳中混入牛乳以此來牟取利益[4-5]。但這樣一種為了獲取經(jīng)濟(jì)利益的摻假方式，不僅會導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不合格，而且損害了消費(fèi)者的健康和權(quán)益[6]，特別是對牛乳過敏的人群，由于不恰當(dāng)?shù)臉?biāo)簽標(biāo)識，使該類人群易飲用了摻入牛乳的羊乳制品而過敏[7]。這種摻假不僅在液態(tài)羊乳及其制品中，更多的會出現(xiàn)在原料乳的收購過程中，因此需要建立一種適宜于企業(yè)和乳站快速檢測羊乳中是否摻入牛乳的方法，以確保羊乳制品質(zhì)量和安全[8]。

依據(jù)羊乳和牛乳化學(xué)組成上的差異，現(xiàn)有的檢測方法多是以牛羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、DNA、維生素等為特征指標(biāo)進(jìn)行檢測[9-12]。?；撬岱植加趧游锝M織細(xì)胞內(nèi)，具有保肝利膽、抗心律失常、預(yù)防心血管疾病和提高免疫力的生理作用，能夠促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育[13-15]。肌醇是一種水溶性維生素，易溶于水，廣泛存在于各種天然動物、植物及微生物組織中，能降低膽固醇、促進(jìn)脂肪代謝等，并對脂肪肝、肝硬化、肥胖等疾病有治療和預(yù)防作用[16]。磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物均是參與遺傳信息儲存、遺傳與表達(dá)的核酸構(gòu)件的生物活性因子，其含量水平與泌乳動物品種以及原料新鮮程度密切相關(guān)[17-19]。

本研究通過分析不同品種及地域的乳制品中不同生長因子的含量發(fā)現(xiàn)，純牛羊乳中?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物的含量均存在顯著性差異。因此本研究利用純羊乳跟純牛乳中?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物的差異性，通過建立的高效液相色譜和氣相色譜技術(shù)對不同品種及地域的乳制品進(jìn)行特征指標(biāo)的分析，同時以這些特征指標(biāo)的樣品數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過總結(jié)不同品種及地域的乳制品中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物的含量的變化規(guī)律結(jié)合主成分分析（PCA），建立了一種基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物作為特征指標(biāo)牛羊乳初步篩查預(yù)判的分析方法。建立以牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物為特征指標(biāo)的評價方法可應(yīng)用于羊乳的真?zhèn)舞b別。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品的采集

純牛乳與純羊乳均由各乳品企業(yè)提供，確保樣品的真實性；鮮羊乳均在各牧場新鮮采集，冷鏈運(yùn)輸，確保樣品的真實性與穩(wěn)定性；羊乳摻假盲樣驗證樣品均為市售。

1.1.2 試劑與材料

肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：87-89-8，純度99.0%），上海安譜實驗科技有限公司；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（CAS號：107-35-7，純度99.9%），上海安譜實驗科技有限公司；三磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：9000-83-3），純度≥96%），上海安譜實驗科技有限公司；二磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：58-64-0，純度≥98%），上海安譜實驗科技有限公司；環(huán)磷酸鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：7665-99-8，純度99%），上海安譜實驗科技有限公司；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：127-40-2，純度99%），美國Sigma有限公司；D-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：137-08-6，純度99%），美國Sigma有限公司；甲醇、乙腈（色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三甲基氯硅烷（GC級，純度≥99.0%），上海麥克林生化科技有限公司；六甲基二硅胺烷（分析純，純度98%），上海麥克林生化科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺、二水乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、無水乙醇、無水碳酸鈉、硫酸鉀、硼酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、高氯酸、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、鹽酸、氯化鈉（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泛酸測定培養(yǎng)基，美國BD公司；植物乳桿菌（ATCC8014），美國BD公司；環(huán)己烷、乙醚、正己烷、無水乙醇、甲基叔丁基醚、二丁基羥基甲苯、甲苯（色譜純），上海安譜實驗科技有限公司；Brij-35（10%）、2-巰基乙醇、四丁基溴化銨，上海安譜實驗科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（GC-2030型，配分流/不分流進(jìn)樣口、FID檢測器），日本島津科技有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1200，包括四元汞、脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、化學(xué)工作站、熒光檢測器、二極管陣列檢測器），美國安捷倫公司；石英毛細(xì)管柱（ZB-5ms型（15.0 m×0.25 mm×0.50μm）），北京艾杰爾科技有限公司；色譜柱（ZORBAX Eclipse-AAA（3.0×150 mm，3.5μm）），美國安捷倫公司；色譜柱（AQ-C18（4.6×250 mm，5μm）），美國安捷倫公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z型），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外-分光光度計（UV-2540），日本島津科技有限公司；超純水儀（ELIX3 Essential+Reference型），廣東丹利科技有限公司；臺式高速離心機(jī)（Allegra 25R），美國貝克曼庫爾特有限公司；多通道平行濃縮儀（MV5型），萊伯泰科儀器股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH.S11-2型），天津泰斯特儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9420A型），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器（美國Talboys EOFO-945007基本型），上海安譜實驗科技股份有限公司；電子天平（Q224-1CN型），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；pH計，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Multifuge X4 Pro冷凍型高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技；超聲波清洗器（KQ－250B型），昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 測定方法

1.2.1 ?；撬釡y定方法

?；撬釡y定參考本課題組吳海智[20]等的方法，應(yīng)用高效液相色譜儀，熒光檢測器，色譜柱：ZORBAX Eclipse-AAA（3.0×150 mm，3.5μm）；流動相：流動相A：流動相B=85∶15；流速：0.5 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：激發(fā)波長：338 nm，發(fā)射波長：425 nm；進(jìn)樣量：1μL。

1.2.2 肌醇測定方法

肌醇測定參考本課題組朱禮[16]等的方法，應(yīng)用氣相色譜儀，氫火焰檢測器（FID），色譜柱：ZB-5ms石英毛細(xì)管柱（15.0 m×0.25 mm×0.50μm）；進(jìn)樣口溫度260℃；進(jìn)樣體積1.0μL，分流比5∶1；色譜柱流速1.48 mL/min；程序升溫條件：120℃保持0 min，10℃/min升溫至190℃，保持7 min，然后50℃/min升溫至280℃，保持4.2 min，共20 min；檢測器溫度280℃；載氣：高純氮?dú)?，純度?9.999；高純氫氣，純度≥99.999，流量30 mL/min；高純空氣，流量400 mL/min。

1.2.3 磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物測定方法

磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物測定參考沈麗[18]等的方法，應(yīng)用高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 m，1.7μm）；流動相：流動相A：20 mmol/L磷酸鉀緩沖液（含5 mmol/L四丁基溴化銨，pH=6.5），流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：259 nm；進(jìn)樣量：2μL。

1.2.4 葉黃素測定方法

葉黃素測定參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)方法[21]GB5009.248-2016，應(yīng)用高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，色譜柱：CT99S05-2546WT C30（4.6 mm×250 m，5μm）；流動相：流動相A：甲醇/水（88+12，體積比，含0.1% BHT），流動相B：甲基叔丁基醚（含0.1% BHT）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：445 nm；進(jìn)樣量：50μL。

1.2.5 泛酸測定方法

泛酸測定參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)方法[22]GB5009.210-2016第一法微生物法，應(yīng)用生化培養(yǎng)箱，SPX-250B-Z型，36℃，20 h；紫外-分光光度計，UV-2540，540 nm；植物乳桿菌（ATCC8014）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

按照1.2中的檢測方法對不同品牌及地域的純牛乳和純羊乳進(jìn)行?；撬?、肌醇、磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素和泛酸含量的測定。對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測含量及主成分分析（PCA），主成分分析（PCA）采用SPSS20.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種及地域的純牛羊乳制品中生長因子含量分析

選取由不同乳品企業(yè)提供的40個純牛乳和40個純羊乳真實樣品，按照1.2中檢測方法分別對5種生長因子?；撬?、肌醇、磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素及泛酸的含量進(jìn)行測定。純牛羊乳中各生長因子含量檢測結(jié)果見圖1～5。由圖1～3可知，?；撬帷⒓〈己土姿嵯佘占捌潢P(guān)聯(lián)化合物3種生長因子純羊乳與純牛乳分界明顯，且含量均存在顯著性差異。純羊乳中?；撬岬暮考s為純牛乳的9倍多；純羊乳中肌醇的含量約為純牛乳的4倍多；純羊乳中磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物的含量最高值約為純牛乳的10倍多。同時，由圖4～5可知，純牛羊乳中葉黃素與泛酸這兩種生長因子含量差異不大。

圖1 純牛羊乳中?；撬釞z測結(jié)果箱線圖

圖2 純牛羊乳中肌醇檢測結(jié)果箱線圖

圖3 純牛羊乳中磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物檢測結(jié)果箱線圖

圖4 純牛羊乳中葉黃素檢測結(jié)果箱線圖

圖5 純牛羊乳中泛酸檢測結(jié)果箱線圖

2.2 不同品種及地域的純牛羊乳制品中生長因子主成分分析（PCA）

PCA是一種通過降維的方法將多個變量轉(zhuǎn)化成一組新的、互相無關(guān)的若干綜合變量，且每個新的綜合變量均能夠反映原始變量信息的統(tǒng)計方法[23-24]。由于PCA是一種無監(jiān)督的分析方法，有一定的局限性，一般僅用來觀察實驗樣品的自然分布和組別關(guān)系[25]。本研究分別選取由不同乳品企業(yè)提供的40個純牛乳和40個純羊乳真實樣品，按照1.2中檢測方法分別對?；撬帷⒓〈?、磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素和泛酸5種生長因子的含量進(jìn)行測定。以80個純牛羊乳制品五種生長因子牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素和泛酸的含量為變量，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。圖6為不同品牌純牛羊乳中?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素和泛酸五種生長因子主成分分析（PCA）碎石圖。由圖可知，純牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種生長因子的方差貢獻(xiàn)率累積達(dá)到95.5%，能夠反映純牛羊乳制品的大部分信息，可以選取這3種生長因子作為特征指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步分析。圖7為選取的80個純牛羊乳制品3種特征指標(biāo)?；撬帷⒓〈己土姿嵯佘占捌潢P(guān)聯(lián)化合物的PCA分析圖，序號1～40號為純牛乳，序號41～80號為純羊乳。由圖7可以看出，純牛乳分布比較集中，純羊乳分布較為分散，但純羊乳與純牛乳能夠完全分開且分界線明顯。

圖6 純牛羊乳中不同生長因子主成分分析（PCA）碎石圖

圖7 純牛羊乳及羊乳盲樣驗證樣品主成分分析（PCA）分析圖

由此可知，通過采用1.2中檢測方法對80個純牛羊乳制品中?；撬?、肌醇、磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素和泛酸的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)純牛羊乳中?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種生長因子的含量均存在顯著性差異。同時通過對5種生長因子進(jìn)行主成分分析（PCA），通過主成分分析（PCA）碎石圖發(fā)現(xiàn)純牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種生長因子的方差貢獻(xiàn)率累積達(dá)到95.5%，且從純牛羊乳主成分分析（PCA）分析圖可知，純羊乳與純牛乳能夠完全分開且分界線明顯。因此，可以選取?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物為特征指標(biāo)對牛羊乳進(jìn)行初步篩查預(yù)判?；谂；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物為特征指標(biāo)結(jié)合主成分分析（PCA）的評價方法可以應(yīng)用于羊乳的真?zhèn)舞b別。

2.3 羊乳摻假盲樣驗證檢測

為判定基于?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物為特征指標(biāo)的評價方法可應(yīng)用于羊乳的真?zhèn)舞b別，根據(jù)1.2中檢測方法對市售的10種純羊乳進(jìn)行?；撬帷⒓〈己土姿嵯佘占捌潢P(guān)聯(lián)化合物3種特征指標(biāo)進(jìn)行盲樣驗證檢測。市售純羊乳盲樣檢測結(jié)果見表1。

表1 市售純羊乳盲樣中?；撬?、肌醇和酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物含量測定結(jié)果

由表1可知，樣品83和樣品87中?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種特征指標(biāo)的含量測定結(jié)果均非常低且與純羊乳制品含量存在顯著差異，檢測結(jié)果顯著異常，由此判斷這兩個樣品為可疑樣品。樣品90中?；撬岷图〈己繙y定結(jié)果均比純羊乳制品正常含量的測定值偏低且未檢出磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物，檢測結(jié)果也存在異常。

為判定本評價方法的準(zhǔn)確性，將市售的10種純羊乳的?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種特征指標(biāo)進(jìn)行主成分分析（PCA），分析結(jié)果如圖7所示。由圖可知，樣品81、樣品82、樣品84～86、樣品88～89均處于純羊乳的分布區(qū)；樣品83和樣品87兩個可疑樣品均處于純牛乳的分布區(qū)；樣品90處于純羊乳和純牛乳分布區(qū)的中間位置，因此預(yù)判樣品83和樣品87兩種羊乳為假冒產(chǎn)品，樣品90純羊乳中可能摻入了一定比例的純牛乳。該結(jié)果與采用1.2中檢測方法進(jìn)行3種特征指標(biāo)含量測定的結(jié)果推斷一致，因此進(jìn)一步證明了本評價方法的準(zhǔn)確性可以應(yīng)用于羊乳的真?zhèn)舞b別。

3 結(jié)論

本研究通過分析不同品種及地域的純牛羊乳制品中不同生長因子?；撬?、肌醇、磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物、葉黃素和泛酸的含量發(fā)現(xiàn)，?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種生長因子含量存在顯著性差異。選取?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物3種生長因子作為特征指標(biāo)，通過建立的高效液相色譜和氣相色譜技術(shù)對不同品種及地域的純牛羊乳制品進(jìn)行3種特征指標(biāo)的含量分析，以這些特征指標(biāo)的樣品數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過總結(jié)不同品種及地域的純牛羊乳制品中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物含量的規(guī)律并結(jié)合主成分分析（PCA）方法，建立了一種基于?；撬?、肌醇和磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物作為特征指標(biāo)羊乳摻假初步篩查預(yù)判的評價方法。通過盲樣樣品驗證證實本評價方法準(zhǔn)確性高，可應(yīng)用于羊乳的真?zhèn)舞b別?；谂；撬?、肌醇和磷酸腺苷及關(guān)聯(lián)化合物作為特征指標(biāo)羊乳摻假初步篩查預(yù)判的評價方法可為牛羊乳摻假技術(shù)的發(fā)展以及整個乳制品行業(yè)的安全發(fā)展提供技術(shù)支持，為進(jìn)一步完善乳制品安全檢測技術(shù)體系和保障乳制品市場的規(guī)范性提供參考。