黃貞杰，陳由強(qiáng)

（1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州362010；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350108）

微生物法生產(chǎn)肌醇研究進(jìn)展

黃貞杰1，陳由強(qiáng)2

（1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州362010；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350108）

肌醇是一種具有旋光性及生物活性的環(huán)狀糖醇，具有許多重要的生理活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。利用微生物法生產(chǎn)肌醇具有很好的應(yīng)用前景。文中介紹了肌醇的功能，綜述了肌醇的微生物酶解法和發(fā)酵法生產(chǎn)的研究進(jìn)展，并對(duì)其前景進(jìn)行了展望。

肌醇，發(fā)酵，微生物催化，釀酒酵母，研究進(jìn)展

肌醇（inositol）又稱環(huán)己六醇，分子式為C6H12O6，相對(duì)分子量是180.16，其外觀為白色結(jié)晶粉末，味微甜，易溶于水，微溶于乙醇、冰乙酸、乙二醇、甘油；不溶于氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑。肌醇在理論上有9種可能的異構(gòu)體（圖1），都為葡萄糖的同分異構(gòu)體。通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的有4種，分別稱為肌肉肌醇（myoinositol）、D-手性肌醇（D-chiro-inositol）、L-手性肌醇（L-chiro-inositol）和鯊肌醇（scyllo-inositol），廣泛存在的為肌肉肌醇（myo-inositol）。

隨著肌醇的新用途不斷被開(kāi)發(fā)，市場(chǎng)需求旺盛，肌醇已成為國(guó)際市場(chǎng)上緊俏的醫(yī)藥化工和保健產(chǎn)品之一。2013年全球醫(yī)藥級(jí)肌醇年需求量達(dá)4000余噸，我國(guó)是肌醇生產(chǎn)和出口大國(guó)，2012年，我國(guó)肌醇出口量達(dá)4156 t，同比增加19.58%。

肌醇的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法可分為水解提取法和化學(xué)合成法。目前普遍使用加壓水解法，以脫脂米糠為主要原料生產(chǎn)肌醇，從米糠或麩皮中提取出植酸鈣，再加壓水解制得肌醇，植酸鹽水解后肌醇得率一般在10%左右，肌醇產(chǎn)率約為1%，但由于肌醇的提取要經(jīng)過(guò)浸提制備植酸鹽、植酸鹽水解為肌醇及其溶液的制備等過(guò)程，而這些過(guò)程中需要耐酸設(shè)備，且存在制備過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)投入高，污染環(huán)境等缺點(diǎn)。這與現(xiàn)代化學(xué)工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)矛盾。所以肌醇供求之間的矛盾必須通過(guò)其他有效途徑來(lái)解決，而用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌醇正是解決這一矛盾的途徑。以下介紹了肌醇的生物活性作用，歸納了國(guó)內(nèi)外關(guān)于肌醇的微生物法生產(chǎn)的研究進(jìn)展。

圖1　肌醇九種異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1　The structures of nine isomers of inositol

1　肌醇生物活性概述

肌醇存在于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)，具有諸多生理功能，是動(dòng)物、微生物的生長(zhǎng)因子，是細(xì)胞膜的組成成分之一，在膜磷脂平衡中扮演著重要的角色。它不僅是胞內(nèi)第二信使磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）合成的前體，而且對(duì)與磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰膽堿（PC）和心磷脂（CL）合成有關(guān)的酶類的表達(dá)具有調(diào)控作用［1］，在鈣平衡和信號(hào)傳遞方面起到重要作用［2］，并能夠保持腦細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整［3］。1928年Eastcott從生物活素中提成了純凈態(tài)的肌醇，并首次發(fā)現(xiàn)其為酵母菌生長(zhǎng)因子［4］。此后，人們對(duì)肌醇的生理藥理活性及應(yīng)用作了更深入的研究。

1.1醫(yī)藥領(lǐng)域

在醫(yī)藥領(lǐng)域中，由于肌醇有類似維生素B1和生物素的功能，作為“生物活素”參與體內(nèi)的新陳代謝活動(dòng)，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、預(yù)防和治療某些疾病等多種作用。因此臨床上肌醇可直接被制成肌醇片，作為藥物輔助治療精神及神經(jīng)性疾?。?］、維生素缺乏癥、血管硬化、糖尿病、肝硬化等多種疾病。肌醇濃度還被證實(shí)與新生兒腦病、阿爾茨海默病、唐氏綜合癥等持續(xù)性神經(jīng)功能障礙有關(guān)［6］。另外，以肌醇為藥物中間體制得的肌醇硒酸酯、氟代肌醇、脈通、煙酸肌醇酯等藥物在治療動(dòng)脈硬化、糖尿病、膽固醇過(guò)高癥、癌癥等方面有很好的療效［7］。Nishino等［8］研究報(bào)道口服肌醇對(duì)肺癌和肝癌有抑制作用。肌醇的甲基衍生物，如松醇、紅杉醇等同樣具有降血糖的作用［9］。另外，肌醇在胰島素的信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用，可用于糖尿病的治療［10］。對(duì)于糖尿病的治療起作用的主要是D-手性-肌醇（DCI）。Xia等［11］以富含DCI的蕎麥和苦瓜治療糖尿病大鼠，效果顯著。人類缺硒可導(dǎo)致癌癥、心血管疾病并加速衰老，而肌醇硒酸酯可用于制備富硒的抗癌藥物、食品。肌醇還可改善PCOS（多囊卵巢綜合癥）女性的胰島素敏感性和排卵功能，治療婦女代謝綜合癥［12-14］。通過(guò)補(bǔ)充肌肉肌醇和D-手性-肌醇（DCI）都可以治療PCOS，且它們屬于不同的信號(hào)通路，Unfer V等［15］比較了肌肉肌醇和DCI對(duì)患PCOS的不育婦女的治療效果，發(fā)現(xiàn)服用肌肉肌醇組有更好更多的成熟卵子，懷孕的人數(shù)也比服用DCI的更多。Nordio M等用復(fù)合的DCI和肌肉肌醇以及單一的肌肉肌醇治療超重的PCOS患者，三個(gè)月后復(fù)合肌醇組更有效果，降低了患代謝綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)［16］。

1.2食品領(lǐng)域

在食品領(lǐng)域，肌醇常作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，美國(guó)1987年就推薦含奶嬰兒食品中應(yīng)加入一定量肌醇。90年代，人們發(fā)現(xiàn)肌醇可與L-肉毒堿結(jié)合使用，可使脂肪很快轉(zhuǎn)化為熱能消耗掉，防止脂肪在人體內(nèi)特別是心血管內(nèi)沉積，具有減肥功效［17］。肌醇還具有抗氧化、抗衰老、抗炎功能，DCI和其他的抗氧化物不同，主要對(duì)超氧陰離子（·O2-），過(guò)氧化氫和羥自由基（·OH）表現(xiàn)出更高的抗氧化活性［18］。

1.3飼料工業(yè)領(lǐng)域

在飼料工業(yè)領(lǐng)域，肌醇主要作為生物促進(jìn)劑。飼料中加入肌醇，可促進(jìn)牲畜生長(zhǎng)和防止出現(xiàn)毛發(fā)脫落及體內(nèi)生理活動(dòng)失去平衡等癥狀。在對(duì)蝦及魚(yú)類干飼料中，肌醇添加量通常為300～500 mg/kg。否則將發(fā)生肌醇缺乏癥，癥狀為食欲不振、飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)停滯。Hada B等發(fā)現(xiàn)向果蠅飼料里添加DCI和松醇，與對(duì)照組相比，通過(guò)激活S6K和JKN通路，增加了轉(zhuǎn)錄因子dFOXO的核定位，最終表現(xiàn)為延長(zhǎng)果蠅的壽命［19］。

2　微生物酶催化法產(chǎn)肌醇

微生物酶催化法產(chǎn)肌醇主要是應(yīng)用微生物產(chǎn)生的植酸酶（phytase）和磷酸酯酶（phosphotase），將植酸及其菲丁水解轉(zhuǎn)化為肌醇的方法。一般植酸鹽在植酸酶作用下分解為肌醇-2-磷酸，然后肌醇-2-磷酸進(jìn)一步在磷酸酯酶作用下生成肌醇。另外，也發(fā)現(xiàn)能將植酸直接水解成肌醇的植酸酶。因此，通過(guò)篩選等手段獲得大量表達(dá)植酸酶和磷酸酯酶的菌種產(chǎn)肌醇；或分離出能將植酸直接水解成肌醇的植酸酶，成為微生物酶催化法產(chǎn)肌醇的途徑。由于酶的反應(yīng)條件比較溫和，可在常溫常壓下進(jìn)行，利用酶催化法生產(chǎn)肌醇，能夠提高產(chǎn)品得率、降低生產(chǎn)成本，能耗低、環(huán)境友好，是肌醇生產(chǎn)發(fā)展新趨勢(shì)。

2.1植酸酶產(chǎn)生菌

植酸酶屬磷酸單酯水解酶，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸（鹽）降解為肌醇和無(wú)機(jī)磷，同時(shí)釋放出與植酸（鹽）結(jié)合的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植酸酶來(lái)源于天然，一種存在于植物體、真菌和細(xì)菌中，另一種存在于植物的貯藏器官（如種子、塊莖）中。在產(chǎn)植酸酶的微生物中，特別值得一提的有：黑曲霉（A.niger）、米曲霉（A.oryzoe）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）和少孢根霉（Rhizopcos.oligorporus）等真菌；細(xì)菌：假單胞菌（Pseudomonassp.）、克雷白桿菌（Klebsiella sp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）；酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）、球擬酵母（Torulopsis Candida）、漢氏德巴利氏酵母（Debaryomycescastellii）、脆 壁 克 魯 維 酵 母（Kluyveromyces fragilis）等能分泌相對(duì)多量的植酸酶。但一般天然植酸酶產(chǎn)生菌菌株生產(chǎn)植酸酶的量較低，每毫升發(fā)酵液只有100～500單位（100～500 U/mL）。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所姚斌研究員小組與生物技術(shù)研究中心范云六院士小組經(jīng)過(guò)幾年的努力采用基因工程技術(shù)建構(gòu)的“工程畢赤酵母”（Pichia pastoris），表達(dá)的植酸酶能分泌到培養(yǎng)基中，表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，與天然植酸酶在酶學(xué)性質(zhì)上沒(méi)有差異，具有正常的生物學(xué)活性，大大提高酶的產(chǎn)率，經(jīng)5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)量達(dá)到15000單位/毫升（約每毫升發(fā)酵液收獲5 mg植酸酶蛋白），比原植酸酶產(chǎn)生菌（Aspergillus niger-963）的產(chǎn)量高3000倍以上；比國(guó)外報(bào)道的“工程菌”（P.pastoris）植酸酶產(chǎn)量高約37倍［20-21］。2010年Gunashree等［22］利用原生質(zhì)體融合技術(shù)提高了菌株植酸酶的活力，固體發(fā)酵培養(yǎng)6～7 d，可達(dá)到最大酶活產(chǎn)量為126.2 U/gds。為獲得在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好的植酸酶產(chǎn)生菌，張慶芳等［23］對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫植酸酶進(jìn)行研究，將產(chǎn)生植酸酶的微生物逐級(jí)低溫馴化后在12～18℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，低溫發(fā)酵結(jié)束后分離純化植酸酶。低溫植酸酶具有低溫高催化活力和高催化效率；能縮短加工過(guò)程的時(shí)間并節(jié)省了昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。

2.2植酸酶和磷酸酯酶催化產(chǎn)肌醇

自然界分離到的能同時(shí)分泌植酸酶和磷酸酯酶的微生物很少，而且產(chǎn)酶能力低，肌醇產(chǎn)率低。無(wú)花果曲霉能同時(shí)分泌植酸酶（E.C.3.1.3.8）和磷酸酯酶（E.C.3.1.3.2），且這兩種酶均具有底物專一性，王建玲等［24］通過(guò)對(duì)無(wú)花果曲霉（A.ficuum A.s3.324）產(chǎn)生植酸酶和磷酸酯酶的條件進(jìn)行研究，在確定的最佳條件下，植酸酶和磷酸酯酶活力分別達(dá)到5.7、0.533 U/mL。用所得發(fā)酵液水解菲丁制備肌醇，使肌醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)10.3%，該轉(zhuǎn)化率與傳統(tǒng)加壓水解法制備肌醇的轉(zhuǎn)化率接近。

Xingen Lei等［25］通過(guò)核酸定點(diǎn)突變獲得多株曲霉植酸酶突變體，提高了植酸酶活力、熱穩(wěn)定性和適宜pH范圍。隨后克隆了Escherichia coli的植酸酶基因phyA和酸性磷酸酶基因appA，分別構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母菌獲得重組菌，利用重組菌過(guò)表達(dá)植酸酶和酸性磷酸酶，通過(guò)發(fā)酵玉米、大豆粉、麩皮，使植酸水解轉(zhuǎn)變?yōu)榧〈己蜔o(wú)機(jī)單磷酸［26］。

2.3高效表達(dá)植酸酶催化產(chǎn)肌醇

目前發(fā)現(xiàn)的絕大部分微生物來(lái)源的植酸酶分解植酸鹽形成的終產(chǎn)物均是單磷酸肌醇和無(wú)機(jī)正磷酸，但Mochizuki等從Schwanniomyces occidentalis中分離出的植酸酶可將植酸鹽分解為肌醇和無(wú)機(jī)磷酸［21］。Melanie等通過(guò)疏水層析從漢氏德巴利氏酵母Debaryomyces castellii分離純化得到能將植酸徹底水解成肌醇的植酸酶，并通過(guò)基因重組技術(shù)過(guò)表達(dá)這種酶，所得酶的性質(zhì)與原酶相同［27-28］。

埃萊娜·布茲等［29］對(duì)Debaryomyces castellii CBS 2923植酸酶的生物合成進(jìn)行研究，克隆該菌株植酸酶基因，進(jìn)行重組過(guò)表達(dá)，獲得的重組株分別產(chǎn)生100（PIC株）和10（GAP株）倍高于野生型Debaryomyces castellii CBS 2923株的植酸酶，隨后進(jìn)行了植酸酶組合對(duì)植酸水解的協(xié)同效應(yīng)研究，將酵母Schwanniomyces castellii的植酸酶或酵母Debaryomyces castellii的植酸酶與黑曲霉Natuphos（AN）的植酸酶等組合，用于將植酸水解為無(wú)機(jī)單磷酸、較低磷酸化水平的肌醇以及游離的肌醇［30］。Ann-Sofie等［31］通過(guò)表達(dá)和敲除植酸酶相關(guān)基因的方法構(gòu)建了提高植酸酶活力的釀酒酵母基因工程菌株，可以用于發(fā)酵產(chǎn)肌醇磷脂異構(gòu)體和肌醇。

生物酶催化在實(shí)現(xiàn)綠色化工方面具有許多優(yōu)勢(shì)：新型、高效率、周期短、選擇性提高、常溫、常壓。酶的反應(yīng)條件比較溫和，通過(guò)避免使用高溫、高壓，避免金屬和有機(jī)溶劑的大量消耗，來(lái)大大降低單位產(chǎn)品的廢物產(chǎn)生量。由此可見(jiàn)，利用生物酶催化的方法生產(chǎn)肌醇是必要的，具有很好的應(yīng)用前景。

3　微生物發(fā)酵法產(chǎn)肌醇

3.1自然選育與誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)肌醇

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌醇，主要以混合糖類合成培養(yǎng)基為原料，以釀酒酵母或假絲酵母等為主要生產(chǎn)菌，經(jīng)一二級(jí)發(fā)酵分泌肌醇到發(fā)酵液中，再對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理，經(jīng)純化、濃縮、結(jié)晶最后得到高純度的肌醇。

早期日本的shirai M團(tuán)隊(duì)對(duì)選育產(chǎn)肌醇菌株做了重要的研究，通過(guò)誘變選育出3種突變株，其中對(duì)葡萄糖代謝拮抗物有抗性的假絲酵母DGR1-14（FERM P-1439或FERMBP-5070等菌種），通氣發(fā)酵34～96 h，肌醇產(chǎn)量在0.4～3 g/L［32-33］。白井真等［34］通過(guò)以誘變獲得的博伊丁假絲酵母IP-2發(fā)酵培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌肌醇，可在細(xì)胞外積累1.5 L的肌醇。勾秋芬等［35］研究利用釀酒酵母對(duì)苦蕎粉進(jìn)行發(fā)酵，提高D-手性肌醇含量。正交優(yōu)化及其驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明最佳發(fā)酵條件組合是溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為34 h，pH為5.5，料液比為1∶10；D-手性肌醇平均含量可以達(dá)到1.82%。

此外，也有研究利用黑曲霉發(fā)酵制取肌醇。劉曉永等［36］以麩皮為原料利用黑曲霉WS-65進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制取肌醇，優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件下的最高肌醇產(chǎn)量為55 mg/100mL。歐仕益等對(duì)利用黑曲霉發(fā)酵麥麩制備阿魏酸、肌醇和低聚糖進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，黑曲霉能部分釋放麥麩膳食纖維上所束縛的阿魏酸，并將多糖和植酸分別水解成低聚糖和肌醇。不過(guò)，由于黑曲酶在釋放這些物質(zhì)的同時(shí)又將它們作為營(yíng)養(yǎng)源，因此，利用黑曲霉直接發(fā)酵麥麩生產(chǎn)這三種物質(zhì)是不經(jīng)濟(jì)的，而利用它們產(chǎn)生的酶來(lái)生產(chǎn)阿魏酸、肌醇和低聚糖可能是更好的選擇［37］。

3.2基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)肌醇

近幾十年來(lái)細(xì)胞生物學(xué)的研究不斷深入，使得酵母菌的肌醇代謝途徑已基本明晰。自然選育的菌株肌醇產(chǎn)率通常較低，因此，采用基因工程和代謝工程技術(shù)，針對(duì)具有清晰基因組信息以及成熟基因操作工具的酵母菌以及大腸桿菌等菌株進(jìn)行改造，以獲得高效肌醇生產(chǎn)菌株。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：利用基因高效表達(dá)和基因敲除技術(shù)改造酵母菌；產(chǎn)肌醇大腸桿菌工程菌的構(gòu)建。

酵母從葡萄糖開(kāi)始合成肌醇的生物合成與代謝途徑見(jiàn)圖2［38］。在肌醇的合成過(guò)程中，肌醇-3-磷酸合成酶是關(guān)鍵酶，該酶的表達(dá)受到其產(chǎn)物肌醇的反饋抑制，野生菌株中肌醇-3-磷酸合成酶只在對(duì)數(shù)期或缺少肌醇的情況下表達(dá)。編碼該酶的基因?yàn)閕no1，該基因已從酵母菌中克隆得到，并進(jìn)行了序列分析［39］。ino1基因是酵母中受控制最嚴(yán)格的基因之一，Ino1′轉(zhuǎn)錄子是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄裝置缺陷的敏感元件，如破壞TATA結(jié)合蛋白或敲除普遍性轉(zhuǎn)錄因子TFIIA，都會(huì)影響Ino1的激活，導(dǎo)致肌醇營(yíng)養(yǎng)缺陷體的出現(xiàn)［40］。對(duì)ino1基因啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)，在其基因的啟動(dòng)子的上游存在一些重復(fù)序列，稱之作UASINO元件。有研究［41］指出UASINO是對(duì)肌醇敏感的序列，如果培養(yǎng)基中含有肌醇，它會(huì)被激活而影響ino1的表達(dá)，酵母細(xì)胞中的肌醇-3-磷酸合成酶便受到阻遏，酶活力下降，細(xì)胞中的肌醇合成停止。ino1的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄激活物Ino2p和Ino4p結(jié)合到UASINO元件上，ino2和ino4基因編碼基本的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（basic helix-loop-helixproteins）作為異質(zhì)二聚體結(jié)合在UASINO元件上［42］。J Anthony Graves和Susan A Henry［43］研究發(fā)現(xiàn)ino2或ino4基因缺陷菌株，不能在缺少肌醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在含有限肌醇的液體培養(yǎng)基里，opi1、ino4基因缺陷菌株Ino1的表達(dá)量要比對(duì)照菌株高，但在含有足量肌醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，Ino1的表達(dá)就會(huì)受到抑制，因此研究表明Opi1p、Sin3p、和Ino2p/Ino4p復(fù)合體會(huì)影響Ino1表達(dá)的總體水平，但與Ino1對(duì)肌醇的反饋應(yīng)答無(wú)關(guān)。Rundlett等研究發(fā)現(xiàn)，ume6和rpd3是Ino1的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，RPD3是一種組蛋白去乙?；?，rpd3缺陷菌株Ino1的表達(dá)量是野生菌的32倍［44］。Yina Wang等研究分析了新生隱球菌肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因itr，結(jié)果表明itr1a和itr3c是10個(gè)候選基因中唯一的兩個(gè)itr基因，它們能夠彌補(bǔ)釀酒酵母肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷株的生長(zhǎng)。異源表達(dá)itr1a或itr3c的釀酒酵母菌株表現(xiàn)出高的肌醇吸收活力，說(shuō)明Itr1a、Itr3c是主要的肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此肌醇的吸收和生物合成途徑對(duì)肌醇生成都是極其重要的［45］。Ye C等［46］研究發(fā)現(xiàn)ino1的轉(zhuǎn)錄受肌醇焦磷酸合成的調(diào)控，并提出通過(guò)調(diào)整肌醇焦磷酸激酶的編碼基因kcs1來(lái)合成肌醇焦磷酸，從而調(diào)控ino1的轉(zhuǎn)錄。在早期，shirai M團(tuán)隊(duì)通過(guò)以利用葡萄糖為誘導(dǎo)物的啟動(dòng)子，將釀酒酵母的磷酸酶基因和假絲酵母的肌醇-1-磷酸合成酶基因在假絲酵母中過(guò)表達(dá)來(lái)生產(chǎn)肌醇［47］。Justin AM等在Escherichia coli中過(guò)表達(dá)擬南芥的磷脂酰肌醇合成酶1，從而發(fā)酵制取肌醇［48］。張厚程等［1］用含有肌醇合成的關(guān)鍵酶基因ino1的兩不同質(zhì)粒對(duì)肌醇營(yíng)養(yǎng)缺陷型粟酒裂殖酵母菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到兩株肌醇合成能力有巨大差異的菌株。

圖2　酵母肌醇的生物合成與代謝途徑Fig.2　The flow chart of biosynthesis and metabolism of myo-inositol in yeast

以上研究表明，為提高肌醇的高效合成，通過(guò)調(diào)控肌醇生物合成與代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)是非常必要的，特別是肌醇合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因ino1。通過(guò)基因工程技術(shù)直接或間接的調(diào)控肌醇合成酶基因的表達(dá)，構(gòu)建高效表達(dá)ino1基因的肌醇基因工程菌，從而提高肌醇的產(chǎn)量，為微生物發(fā)酵法產(chǎn)肌醇奠定基礎(chǔ)。

另一方面，Breenberg等采用遺傳工程方法研究揭示了，S.cerevisiaes中至少存在opi1、opi2、opi4三個(gè)基因位點(diǎn)，這些基因?qū)〈嫉纳锖铣申P(guān)鍵酶的合成起阻遏作用，它們之間及與肌醇合成關(guān)鍵酶基因ino1互不連鎖［38］。隨后，White和Henry采用基因工程技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證明了opi1是磷脂生物合成的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，它編碼的蛋白質(zhì)是肌醇生物合成的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)子，Ashburner的研究也指出，opi1基因表達(dá)產(chǎn)物是肌醇應(yīng)答的主要靶目標(biāo)，能夠抑制Ino2轉(zhuǎn)錄子決定靶基因的表達(dá)程度；在包含gal1-ino2的菌株中，通過(guò)敲除opi1基因能夠解除肌醇對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的影響［49］。在諸多研究的基礎(chǔ)上，White等通過(guò)敲除opi1基因位點(diǎn)獲得了能多產(chǎn)肌醇的基因工程菌YS2（ATCC-74033）等［50］。A grawal.P等［51］利用敲除了opi1基因的野生S.cerrevisae，即基因工程菌YS2（ATCC-74033）和YS3（ATCC-74034）進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)肌醇。采用含葡萄糖100 g/L、硫酸銨作為氮源的合成營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，肌醇產(chǎn)率是單糖發(fā)酵液中肌醇濃度的10倍。利用杏仁殼浸漬汁的物料進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后肌醇含量達(dá)9 g/L（接近或超過(guò)了化學(xué)提取法水平），使肌醇濃度提高50%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析知，因培養(yǎng)基不同，其發(fā)酵類型表現(xiàn)為一、二型發(fā)酵，較高濃度的葡萄糖對(duì)肌醇產(chǎn)生有抑制作用。該團(tuán)隊(duì)隨后研究［52］，發(fā)現(xiàn)了一種從糖類混合發(fā)酵液中純化肌醇的方法。方法中采用不優(yōu)先利用肌醇作為碳源的野生S.cerrevisae（DD2、aDD2）對(duì)含糖、肌醇、山梨醇等不同成分的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后除山梨醇仍有小部分剩余外，其他糖類物質(zhì)均在38 h內(nèi)被完全轉(zhuǎn)化。經(jīng)DD2、aDD2發(fā)酵處理過(guò)的肌醇發(fā)酵液再濃縮結(jié)晶后得到了高純度的肌醇結(jié)晶產(chǎn)品。因此，加大對(duì)培養(yǎng)基等發(fā)酵條件和發(fā)酵液后處理的研究，有利于目標(biāo)產(chǎn)物肌醇的積累和分離純化，提高肌醇生產(chǎn)效益。

2013年日本再次公布了多篇關(guān)于微生物法生產(chǎn)肌醇方面研究的相關(guān)專利。KONISHI Kazunobu［53］團(tuán)隊(duì)利用基因重組技術(shù)結(jié)合使用合成生物學(xué)技術(shù)，對(duì)不具有內(nèi)源肌醇生物合成途徑的大腸桿菌進(jìn)行重組改造，得到能夠生產(chǎn)肌醇和肌醇衍生物（1-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-肌-肌醇）的工程菌株，分別是AKC-018菌株和AKC-016-G22菌株。AKC-018菌株在含30 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵23.5 h，肌醇產(chǎn)量為1.84 g/L。該團(tuán)隊(duì)還研究提供了一步法發(fā)酵生產(chǎn)鯊肌醇的方法，通過(guò)構(gòu)建含有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肌醇脫氫酶基因、鯊肌醇脫氫酶基因的重組菌株，該菌株在合成培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)68 h后，分離發(fā)酵液上清液，HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，鯊肌醇含量量高達(dá)12.4 g/L［54］。SEMBA Hisashi等［55］通過(guò)降低糖酵解酶的活性，高表達(dá)肌醇合成酶基因，獲得高產(chǎn)肌醇的釀酒酵母突變株，通氣發(fā)酵培養(yǎng)31.5 h，檢測(cè)結(jié)果肌醇產(chǎn)量為4.0 g/（L·day）。

此外，Yamaoka M等［56］報(bào)道，枯草芽孢桿菌能夠代謝合成肌醇，包括肌肌醇、D-手性肌醇、鯊肌醇等。Kosei Tanaka等［57］研究進(jìn)一步提高枯草芽孢桿菌內(nèi)鯊肌醇轉(zhuǎn)化效率。通過(guò)在已敲除相關(guān)基因的枯草芽孢桿菌MYI04細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)肌醇轉(zhuǎn)化為鯊肌醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因iolG、iolW，工程菌在含有2%（w/v）蛋白胨的培養(yǎng)基中發(fā)酵鯊肌醇生產(chǎn)率為10 g/L·48 h以上。

在肌醇基因工程菌研究方面，作者所在課題組已克隆得到釀酒酵母ino1基因序列全長(zhǎng)，構(gòu)建了超表達(dá)ino1基因的整合表達(dá)載體［58］，轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y01，獲得重組菌。并研究證實(shí)肌醇對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)有調(diào)控作用，能夠提高釀酒酵母細(xì)胞活力，對(duì)酵母耐高乙醇起著重要作用，與Hong ME等研究一致［59］。

4　展望

綜上，微生物法生產(chǎn)肌醇，具有巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力，發(fā)展和應(yīng)用生物高新技術(shù)，用其推動(dòng)肌醇生產(chǎn)，提高產(chǎn)品純度，逐步降低產(chǎn)品成本，是肌醇生產(chǎn)研究的趨勢(shì)。為適應(yīng)市場(chǎng)多方面的需求，微生物發(fā)酵工程及其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展是必然趨勢(shì)，而獲取優(yōu)化的微生物發(fā)酵肌醇產(chǎn)品的關(guān)鍵還在于加強(qiáng)選育高產(chǎn)、高效、優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌種，并保持其在生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定性和適應(yīng)性，因此，如何利用基因工程手段獲得高產(chǎn)率的生產(chǎn)菌株和通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化實(shí)現(xiàn)肌醇的高效生產(chǎn)是未來(lái)的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)?？梢詮囊韵聨讉€(gè)方面著手：利用基因工程技術(shù)進(jìn)一步改造菌種，對(duì)肌醇合成途徑的正負(fù)調(diào)控同時(shí)改造，先過(guò)表達(dá)肌醇合成酶基因ino1，再敲除對(duì)肌醇的生物合成起阻遏作用的基因opi1，并敲除用于篩選用的抗生素抗性基因，最終構(gòu)建安全無(wú)毒害的肌醇基因工程菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。選育葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物等抗性高產(chǎn)菌株。深入研究肌醇發(fā)酵機(jī)理，實(shí)行有效代謝調(diào)控方案。優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以廉價(jià)非糧生物質(zhì)為發(fā)酵底物，降低肌醇發(fā)酵生產(chǎn)的底物利用成本，提高生產(chǎn)效益。上述研究成果正是完成肌醇發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，鞏固已有的研究成果，繼續(xù)探索和創(chuàng)新，微生物法生產(chǎn)肌醇前景廣闊。

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Advances in microbial production of inositol

HUANG Zhen-jie1，CHEN You-qiang2
（1.Quanzhou Medical College，Quanzhou 362010，China；2.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

Inositol，a kind of cyclic sugar alcohol which has optical activity and biological activity，has significant physiological functions and it is widely used in the fields including medicine，food and feed.Microbial production of inositol had broad application potentials.In this article，the functions of inositol，research development of fermentation and microbial enzymatic hydrolysis ways to produce inositol were described.Furthermore，prospect and tendency of microbial production of inositol were addressed.

inositol；fermentation；microbial catalyzing；Saccharomyces cerevisiae；advances

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0384-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.070

2014－10－28

黃貞杰（1987-），男，碩士，助教，研究方向：應(yīng)用微生物與發(fā)酵技術(shù)，E-mail：hzj887@126.com。

福建省醫(yī)藥衛(wèi)生科研人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助計(jì)劃（2014-1-87）；泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?！皣?guó)家骨干院校建設(shè)”重點(diǎn)資助科研項(xiàng)目（XJ1317）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS-20-4-4）。