李穎，劉雁鳴，鄭金鳳，謝瑩瑩，張悅，劉楊，蔣赟（1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，長沙 410001；2.湖南省藥品審查核驗(yàn)中心，長沙 410209；3.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410001）

尿素又稱碳酰胺、脲，在臨床上作為脫水藥、利尿藥及角質(zhì)軟化藥等；由于該藥具有抗菌，使蛋白質(zhì)溶解、變性，增加蛋白質(zhì)水合，增加皮膚通透性等作用，作為輔料在藥劑中主要用作透皮促進(jìn)劑及助溶劑，以增加藥物在水中的溶解度[1]。同時(shí)，尿素還可用于注射劑、口服制劑和外用制劑[2]。由于藥用尿素的廣泛應(yīng)用，其需求量逐年上漲[3]。需對(duì)其含量測定《中國藥典》（ChP2020）、歐洲藥典（EP10.0）和日本藥典（JP17）中均采用氮測定法[4-7]，僅美國藥典（USP43）中采用HPLC 法[8]。本文比較了凱氏定氮法、HPLC-CAD 法和HPLC-UV 法3 種測定尿素含量的方法，以尋找一種簡便、有效、適用性高的方法。

1 材料

1.1 儀器

凱氏定氮裝置[4]；U3000 電噴霧高效液相色譜儀（CAD 檢測器，賽默飛公司）；e2695高效液相色譜儀（UV 檢測器，Waters 公司）；MS105DU 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試藥

尿素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100288-201903，純度：99.8%）；縮二脲（麥克林，批號(hào)：C10871148，純度：98%）；三聚氰酸（麥克林，批號(hào)：C10691090，純度：98%）；縮三脲（上海旭東海普南通藥業(yè)有限公司，批號(hào)：190601，純度：99.0%）；乙腈（Merck 公司，批號(hào)：JA079030，色譜級(jí)）；收集尿素樣品9 批；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 鹽酸滴定液（0.2 mol·L－1） 取鹽酸18 mL，加水至1000 mL，搖勻。按照ChP2020年版通則8006 鹽酸滴定液標(biāo)定。

2.1.2 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取縮二脲、縮三脲、三聚氰酸和尿素適量，用75%乙腈溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.005、0.005、0.005（約相當(dāng)于0.1%的濃度）和5.0 mg·mL－1的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液 取本品，加75%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL 中含0.2 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.1.4 對(duì)照品溶液1 精密稱取尿素對(duì)照品90.51 mg，至10 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL 中含9.033 mg 尿素的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用75%乙腈稀釋制成質(zhì)量濃度為 90.33、135.49、180.65、225.82、451.64 μg·mL－1的線性系列溶液。

2.1.5 對(duì)照品溶液2 精密稱取尿素對(duì)照品約96.71 mg，至10 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL 中含9.652 mg 尿素的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用75%乙腈稀釋制成質(zhì)量濃度為96.52、144.77、193.03、241.29、482.58 μg·mL－1的線性系列溶液。

2.2 凱氏定氮法

參考ChP2020 四部尿素各論[4]下的含量測定項(xiàng)進(jìn)行測定。

2.2.1 重復(fù)性測試 取同一批供試品（批號(hào)：20180301）共6 份，按ChP2020 四部的條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性結(jié)果表(%)Tab 1 Repeatability (%)

2.2.2 含量測定 本品在ChP2020 中的限度為：含CH4N2O 不得少于99.5%。第一次含量考察結(jié)果6 份樣品有3 份未達(dá)到要求；根據(jù)其原理及試驗(yàn)操作過程[9-13]，課題組認(rèn)為是否消解完全會(huì)直接影響含量測定結(jié)果，第二次對(duì)尿素含量測定進(jìn)行考察時(shí)，對(duì)上述可能存在的問題進(jìn)行了排除。嚴(yán)格控制消解時(shí)火爐的火力大小，使樣品一直處于沸騰狀態(tài)，樣品完全消解，結(jié)果均能符合限度要求，且滴定結(jié)果的平行性好（RSD＝0.26%）。

2.3 HPLC-CAD 法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；電噴霧檢測器霧化溫度：35℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取空白溶劑（75%乙腈）及“2.1”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶劑對(duì)主峰無干擾，各雜質(zhì)峰之間以及與尿素主峰之間的分離度均滿足要求。典型圖譜見圖1。

圖1 HPLC-CAD 典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of HPLC-CAD

2.3.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取“2.1.4”項(xiàng)下線性系列溶液各10 μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y＝0.013X－0.5595，R2＝0.9997。結(jié)果表明，尿素在90.33 ～451.64 μg·mL－1內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.3.4 檢測限和定量限 分別精密量取“2.1.4”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，逐級(jí)稀釋，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。設(shè)定量限S/N＝10，檢測限S/N＝3，結(jié)果檢測限為0.0020 μg·mL－1，定量限為0.0067 μg·mL－1。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：20180301），連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得尿素峰面積的RSD（n＝6）為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：20180301）共6 份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定，計(jì)算尿素的含量為99.11%，RSD為2.1%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，于0、2、4、8、12 h 分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，測得尿素峰面積的RSD為4.2%（n＝5），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 回收試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：20180301）共6 份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置于50 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入尿素對(duì)照品儲(chǔ)備液（9.033 mg·mL－1）0.25 mL，加75%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為回收率測定溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算尿素的平均回收率為99.15%，RSD為1.4%（n＝6），表明本方法的回收率良好。

2.4 HPLC-UV 法

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：195 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取空白溶劑（75%乙腈）、系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶劑對(duì)主峰無干擾、各雜質(zhì)峰之間以及與尿素主峰之間的分離度均滿足要求。典型圖譜見圖2。

圖2 HPLC-UV 典型色譜圖Fig 2 Typical chromatogram of HPLC-UV

2.4.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取“2.1.5”項(xiàng)下的線性系列溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y＝3.4385×103X＋1.9593×104，R2＝0.9996。結(jié)果表明，尿素在96.52 ～482.58 μg·mL－1內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4.4 檢測限和定量限 分別精密量取“2.1.5”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別逐級(jí)稀釋，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。設(shè)定量限S/N＝10，檢出限S/N＝3，結(jié)果檢測限為0.62 μg·mL－1，定量限為2.06 μg·mL－1。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：20180301），按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，測得尿素峰面積的RSD為0.42%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：20180301）共6 份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算尿素的含量為99.81%，RSD為0.35%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：20180301），于0、2、4、8、12 h 分別按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，測得尿素峰面積的RSD為0.30%（n＝5），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 回收試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：20180301）共6 份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置50 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入尿素對(duì)照品儲(chǔ)備液（9.652 mg·mL－1）0.25 mL，加75%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為回收率測定溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算尿素的回收率為100.09%，RSD為0.96%（n＝6），表明本方法的回收率良好。

2.5 樣品含量測定

取9 批供試品，分別按照3 種不同的方法進(jìn)行測定，運(yùn)用SPSS 軟件配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)尿素含量的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表2 及表3。

表2 含量測定結(jié)果(%)Tab 2 Content determination (%)

表3 3 種方法配對(duì)t 檢驗(yàn)Tab 3 Paired t-test of the 3 methods

綜上，3 種含量測定方法測得的結(jié)果基本一致，配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示P均小于0.05，表明3種方法間成顯著相關(guān)。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)尿素含量的測定方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明采用3 種方法測定尿素含量測定結(jié)果基本一致，互相證明了3 種方法結(jié)果的可靠性。

傳統(tǒng)凱氏定氮法測定尿素的含量，雖然成本低廉，但是操作過程煩瑣，分析時(shí)間長，影響因素多，試驗(yàn)第一步消解為尿素與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，凱氏燒瓶中的溶液在緩緩加熱至溶液呈澄明的綠色，此時(shí)能明顯觀察到凱氏燒瓶中彌漫了白霧，火力需始終保持樣品溶液在白霧中沸騰再保持加熱30 min。此時(shí)，火爐的火力控制不當(dāng)，樣品消解不完全會(huì)造成含量偏差過大?；鹆μ?，白霧會(huì)沖出凱氏燒瓶，無法使樣品反應(yīng)完全；火力太小，樣品達(dá)不到沸騰狀態(tài)，也無法完全消解樣品。另外，使用的定氮儀是采用通則0704 氮測定法的裝置，該裝置搭建煩瑣，且該試驗(yàn)需要加熱蒸餾，“俟氨餾盡”，這樣的字眼在試驗(yàn)過程中不能簡單明了地判斷，接收餾液不全，直接影響樣品的含量。此外，ChP2020 采用的氮測定法是對(duì)含氮量的測定，而非針對(duì)尿素主成分本身，因此該方法的專屬性存在一定的問題，可操作性差。HPLC-CAD 法可排除縮二脲、縮三脲和三聚氰酸等雜質(zhì)的干擾，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度與精密度均良好，簡便易操作[14-15]；但電噴霧檢測器在市場上的普及率相對(duì)較低，儀器的維護(hù)成本較高。HPLC-UV 法既能準(zhǔn)確地測定尿素的含量，還可以測定除尿素外的其他雜質(zhì)含量，且儀器的市場普及率高；綜合考慮，認(rèn)為HPLC-UV 法更能廣泛地應(yīng)用到尿素含量的測定中。本研究可為尿素及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及開發(fā)提供理論依據(jù)。