錢(qián)曉慶，張楠，李佳鵬，馮悅虎，張玉*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；3.工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；4.武漢和平生物環(huán)保有限公司，武漢 430068)

高通量測(cè)序技術(shù)是一種在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)數(shù)千至數(shù)億條核酸分子進(jìn)行序列檢測(cè)，快速分析出待測(cè)樣本中群落結(jié)構(gòu)及多樣性的新技術(shù)。此前，研究微生物多樣性的方法主要包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法[1]、變性梯度、溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)法等。然而這些方法都存在局限性，如傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法無(wú)法將樣品中的微生物全部分離，且時(shí)間成本高[2]；變性梯度、溫度梯度凝膠電泳法的分辨率較低[3]。而高通量測(cè)序技術(shù)能夠檢測(cè)出存活率低和能存活但不可培養(yǎng)的微生物，使得待測(cè)樣本的微生物群落信息更為全面有效，在環(huán)境[4]、醫(yī)學(xué)[5]、發(fā)酵食品[6-8]等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。

臭鱖魚(yú)是一種將新鮮鱖魚(yú)經(jīng)鹽腌、短期自然發(fā)酵而成的發(fā)酵水產(chǎn)品，風(fēng)味獨(dú)特、味道鮮美，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。現(xiàn)有研究表明，臭鱖魚(yú)特征風(fēng)味的形成與發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性息息相關(guān)。Yang等[9]取鱖魚(yú)發(fā)酵后期的發(fā)酵液用于16S rRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵后期Psychrilyobacter、梭桿菌屬、弓桿菌屬(Arcobacter)和Oceanisphaera等微生物通過(guò)影響蛋白質(zhì)水解促進(jìn)臭鱖魚(yú)風(fēng)味物質(zhì)的形成和釋放，改善了產(chǎn)品的整體風(fēng)味和香氣?？聺扇A[10]采用魚(yú)肉組織取樣，微生物多樣性分析結(jié)果表明乳桿菌、乳球菌等是臭鱖魚(yú)風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者。Wang等[11]對(duì)比研究了臭鱖魚(yú)背部肉樣和腹部肉樣，其微生物多樣性和風(fēng)味存在顯著差異。目前，不同取樣方法(滲出液、魚(yú)體外表面擦拭物及魚(yú)肉組織)對(duì)臭鱖魚(yú)微生物多樣性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用3種取樣方式(滲出液、魚(yú)體外表面擦拭物和魚(yú)肉組織)對(duì)臭鱖魚(yú)樣本進(jìn)行取樣，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)取得的樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，明確了不同取樣方式下臭鱖魚(yú)樣品的優(yōu)勢(shì)菌群及差異。本研究結(jié)果可為分析發(fā)酵產(chǎn)品微生物多樣性在選擇取樣方式方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

臭鱖魚(yú)(500±50) g購(gòu)于安徽老徽鄉(xiāng)食品有限公司，帶制冷劑運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，貯藏于-18 ℃冰箱中備用。

1.2 試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒:美國(guó)Omega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒:美國(guó)Axygen Biosciences公司；氯化鈉(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

JE2002G型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YLY-100BU型超純水機(jī) 深圳市億利源水處理設(shè)備有限公司；SCI-VS型旋渦混勻儀 北京海天友誠(chéng)科技有限公司；DSX-24L型手提式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BCM-1000型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Himac CF16RN型多功能離心機(jī) 日立(中國(guó))有限公司；BCD-520WDPD型冰箱 海爾智家股份有限公司；DW-86L828W型海爾超低溫冰箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微生物取樣

滲出液樣品的取樣：將帶包裝的臭鱖魚(yú)置于4 ℃冰箱中至完全解凍，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上打開(kāi)包裝，取內(nèi)包裝袋滲出液5 mL于無(wú)菌離心管中，12000 r/min離心10 min，棄去上清液，所得沉淀為臭鱖魚(yú)滲出液樣品(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為J樣品)。

魚(yú)體外表面擦拭物樣品的取樣：在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上將上述臭鱖魚(yú)從內(nèi)包裝袋中取出，用潤(rùn)濕無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌棉簽擦拭魚(yú)體外表面，得魚(yú)體外表面擦拭物樣品(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為W樣品)。

魚(yú)肉樣品的取樣：在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，將上述臭鱖魚(yú)去皮后，取5.0 g背部魚(yú)肉組織并剪碎于無(wú)菌離心管中，加入50 mL無(wú)菌生理鹽水，渦旋混勻10 min。棄去大塊魚(yú)肉后以12000 r/min離心10 min，所得沉淀為魚(yú)肉樣品(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為R樣品)。

1.4.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

按照細(xì)菌DNA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的提取純度和濃度[12]，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)作為引物對(duì)細(xì)菌的16S rDNA基因V3～V4區(qū)域[13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并用DNA熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。

1.4.3 微生物樣本高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

將所得微生物樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq技術(shù)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用該公司的生信云平臺(tái)(https://cloud.majorbio.com/)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。使用Usearch(5.2.236)、Uchime(4.2.40)去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體。將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，然后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)。通常對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落的α多樣性分析

采用3種取樣方式對(duì)臭鱖魚(yú)進(jìn)行測(cè)序分析，分別得到44411，42852，63678條有效序列。由圖1可知，基于細(xì)菌OTU數(shù)的各樣品稀釋曲線隨著測(cè)序深度的增加逐漸趨于平緩，不同取樣方式樣品中微生物的Coverage指數(shù)都為0.99(見(jiàn)表1)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量充分，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映3種樣品細(xì)菌的物種信息。

圖1 3種樣品細(xì)菌Shannon指數(shù)稀釋曲線

表1 3種樣品中細(xì)菌的α多樣性分析

可以通過(guò)分析α多樣性來(lái)評(píng)估微生物物種的豐富度和多樣性。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)描述了不同樣品中微生物群落的豐富度，其數(shù)值越大，微生物群落豐富度越高；Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)描述了不同樣品中微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，則微生物多樣性越高；Coverage指數(shù)用來(lái)反映樣品微生物群落覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高[14-16]。

由表1可知，臭鱖魚(yú)樣品的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)最大，說(shuō)明魚(yú)肉樣品中細(xì)菌豐度最高，這可能是因?yàn)槌赭Z魚(yú)發(fā)酵完成后立即包裝并進(jìn)行速凍，此時(shí)所有微生物主要集中在魚(yú)肉部分及部分附著在魚(yú)體表面。滲出液樣品的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為最高和最低，說(shuō)明滲出液樣品中細(xì)菌多樣性更加豐富，這可能是由于在-18 ℃貯藏期間，部分嗜冷菌在魚(yú)體表面緩慢生長(zhǎng)；而且在解凍時(shí)，魚(yú)體內(nèi)部微生物隨滲出液擴(kuò)散至魚(yú)體外部；此外，樣本解凍時(shí)間較長(zhǎng)，中心溫度從-18 ℃逐漸升高，魚(yú)體外表面溫度一直處于4 ℃，且包裝袋內(nèi)留存有一定量的氧氣，部分微生物在此環(huán)境下開(kāi)始生長(zhǎng)。因而滲出液樣品中細(xì)菌多樣性比魚(yú)肉樣品和魚(yú)體外表面擦拭物樣品中細(xì)菌多樣性高。

OTU樣本分布韋恩圖見(jiàn)圖2，3種取樣方式樣品的OTUs共有數(shù)為56，滲出液樣品、魚(yú)肉樣品和魚(yú)體外表面擦拭物樣品的OTUs獨(dú)有數(shù)分別為7，4，1。與其他兩種取樣方式相比，滲出液樣品中細(xì)菌OTUs獨(dú)有數(shù)最大，與其微生物多樣性最高的結(jié)果一致。

圖2 3種樣品細(xì)菌韋恩圖分析

2.2 基于門(mén)水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知，在門(mén)分類水平上，3種樣品的細(xì)菌相對(duì)豐度>1%的共有菌門(mén)為5個(gè)，分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，58.28%、11.04%、20.25%)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteriota，23.40%、68.69%、62.03%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，7.78%、6.58%、2.39%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota，5.34%、8.09%、9.44%)和螺旋體門(mén)(Spirochaetota，2.25%、4.91%、4.94%)。魚(yú)肉樣品和魚(yú)體外表面擦拭物樣品主要菌門(mén)一致，但在相對(duì)豐度上存在差異。此外，滲出液樣品中細(xì)菌相對(duì)豐度>1%的還有放線菌門(mén)(Actinobacteriota，2.86%)，這是因?yàn)闈B出液樣品中氧氣含量相對(duì)較高，而放線菌大多數(shù)為好氧菌，因而能更好地生長(zhǎng)繁殖。

圖3 門(mén)水平上3種樣品的細(xì)菌豐度分析

2.3 基于屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

3種樣品在屬水平上細(xì)菌菌屬的總體概況見(jiàn)圖4，3種樣品中共有的菌屬主要為Psychrilyobacter(14.24%、46.44%、32.80%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，9.15%、22.25%、29.24%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，31.65%、7.19%、11.60%)、漫游球菌屬(Vagococcus，17.70%、2.14%、6.62%)、擬桿菌屬(Bacteroides，5.33%、8.08%、9.44%)、球藻菌屬(Sphaerochaeta，2.25%、4.91%、4.94%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，7.13%、1.25%、1.31%)、肉食桿菌屬(Carnobacterium，6.97%、0.43%、0.80%)等。滲出液樣品中乳桿菌屬和漫游球菌屬的優(yōu)勢(shì)較為明顯；魚(yú)肉樣品與魚(yú)肉外表面擦拭物樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬一致，為Psychrilyobacter和梭桿菌屬。

圖4 屬水平上的3種樣品的細(xì)菌豐度分析

3個(gè)樣品在屬水平上的差異來(lái)源于微生物的生長(zhǎng)特異性，乳桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性厭氧，有時(shí)微好氧，廣泛存在于發(fā)酵食品的微生物群落中[17-18]。漫游球菌屬能夠進(jìn)行發(fā)酵代謝，利用一些碳水化合物產(chǎn)生乳酸，能合成蛋白酶、碳水化合物活性酶等，促進(jìn)蛋白質(zhì)、碳水化合物的分解[19]。乳桿菌屬和漫游球菌屬能夠加速乳酸積累，降低pH值，抑制其他微生物的生長(zhǎng)，因而在滲出液樣品中具有較高的豐度。此外，乳桿菌也能夠產(chǎn)香味化合物，提高臭鱖魚(yú)特征風(fēng)味化合物含量[20]；Psychrilyobacter能夠加速蛋白質(zhì)水解，釋放游離氨基酸，梭桿菌屬是革蘭氏陽(yáng)性菌，專性厭氧，Psychrilyobacter和梭桿菌屬在魚(yú)肉樣品中均具有較高的豐度，這可能是因?yàn)槎叨寄芾敏~(yú)肉中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。此外，Psychrilyobacter和梭菌屬是鱖魚(yú)發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)微生物，與芳樟醇、乙酸香葉酯、順式香芹醇、吲哚等特征香氣有關(guān)。擬桿菌屬(Bacteroides)是革蘭氏陰性厭氧菌，因此在魚(yú)肉樣品和表面樣品中相對(duì)豐度較高，在滲出液樣品中相對(duì)豐度低；肉食桿菌屬在滲出液樣品中相對(duì)豐度最高，該菌可產(chǎn)生2,3-丁二酮、2,3-戊二酮等揮發(fā)性物質(zhì)，是鮭魚(yú)、蝦等水產(chǎn)品中的主要腐敗菌[21-22]；弧菌屬在魚(yú)肉樣品中相對(duì)豐度較高，可能是由于弧菌具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，能夠利用魚(yú)肉中豐富的蛋白質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，也是水產(chǎn)品的特定腐敗菌[23]。

由于不同菌屬對(duì)氧氣的需求量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用程度不同，因此在滲出液樣品、魚(yú)體外表面擦拭物樣品和魚(yú)肉樣品中檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度有所差異。3種樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)鱖魚(yú)的發(fā)酵均具有重要意義，取樣方式不同，微生物多樣性存在差異，對(duì)后續(xù)臭鱖魚(yú)風(fēng)味化合物與其微生物的關(guān)聯(lián)分析造成影響。

2.4 基于屬水平的主成分分析

由圖5可知，第一主成分的貢獻(xiàn)率為83.70%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為16.31%，累計(jì)貢獻(xiàn)率約為100%。3種樣品分布于不同區(qū)域，滲出液樣品位于PC1的負(fù)端區(qū)域及PC2的正端區(qū)域；魚(yú)肉樣品主要分布于PC1的正端區(qū)域及PC2的負(fù)端區(qū)域；魚(yú)肉外表面擦拭物樣品主要分布于PC1的正端區(qū)域及PC2的正端區(qū)域附近。將3種取樣方式樣品向PC1軸投影，魚(yú)肉樣品和魚(yú)肉外表面擦拭物樣品均位于PC1軸右側(cè)，且兩者較為接近，而滲出液樣品位于PC1軸左側(cè)，遠(yuǎn)離魚(yú)肉樣品和魚(yú)肉外表面擦拭物樣品位置。由于PC1的貢獻(xiàn)率為83.70%，能夠概括絕大部分的樣品信息，因此魚(yú)肉樣品和魚(yú)肉外表面擦拭物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，與滲出液樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖5 基于屬水平的3種樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同取樣方式對(duì)臭鱖魚(yú)細(xì)菌多樣性的影響。結(jié)果表明，魚(yú)肉樣品和魚(yú)體外表面擦拭物樣品中細(xì)菌多樣性相似，而與滲出液樣品中細(xì)菌多樣性存在差異。魚(yú)肉樣品的細(xì)菌豐度最高，說(shuō)明微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富的魚(yú)肉中進(jìn)行厭氧或兼性厭氧生長(zhǎng)繁殖，魚(yú)肉樣品中Psychrilyobacter和梭桿菌屬為主要菌屬。滲出液樣品中的微生物多樣性最高，這可能與產(chǎn)品包裝時(shí)環(huán)境情況和人為操作有關(guān)，滲出液樣品中乳桿菌屬和漫游球菌屬為主要菌屬。綜合主成分和物種豐度聚類熱圖分析，魚(yú)肉樣品和魚(yú)體外表面擦拭物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，與滲出液樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。因此在取樣過(guò)程中，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。若要保證產(chǎn)品無(wú)損，則可選擇魚(yú)體外表面擦拭物取樣，方便快捷；若樣本為成品發(fā)酵魚(yú)，則可選擇魚(yú)肉取樣，可得到數(shù)量更為豐富的微生物；若樣本為發(fā)酵過(guò)程中的魚(yú)產(chǎn)品，則可選擇發(fā)酵液和魚(yú)肉取樣，可得到更為全面的微生物多樣性信息，且有助于從中分離得到發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味化合物形成的核心菌株。