解春芝，舒德昌，毛曉悅，郭 敏，陳 婷，劉恩岐

（1. 徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2. 江蘇美鑫食品科技有限公司，江蘇 徐州 221018）

食用菌又被稱為蕈，是一種高附加值的大型真菌。作為佐膳佳品，食用菌富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有高蛋白、低糖、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)[1-2]。此外，食用菌中含有多種生物活性物質(zhì)，如多糖、膳食纖維、甾體、多酚等，賦予其降血糖、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善睡眠等生理功能[3-5]。

食用菌還含有豐富的揮發(fā)性風(fēng)味成分、多種游離氨基酸及不飽和脂肪酸，具有濃郁、獨(dú)特的香味，使之成為制備湯制品的優(yōu)質(zhì)原材料。目前，針對(duì)食用菌的風(fēng)味研究取得了一定的進(jìn)展[6-7]。來(lái)靜等人[8]以三黃雞和食用菌為原料熬制食用菌雞湯，對(duì)雞湯灰分、粗脂肪、總糖、呈味核苷酸含量及揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)食用菌的添加提高了雞湯的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)并促進(jìn)了風(fēng)味物質(zhì)的形成。Xun W 等人[9]以夏塊莖、芝角菌、松茸、牛肝菌為材料熬制湯料，測(cè)定了4 種食用菌湯的揮發(fā)性特征風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸，并對(duì)比分析了4 種湯料風(fēng)味特征的差異。Zhang H 等人[10]采用固相微萃取法提取牛肝菌揮發(fā)性化合物，用氣相色譜- 質(zhì)譜法和氣相色譜- 液相色譜法進(jìn)行鑒定，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究了其感官屬性與揮發(fā)性成分的關(guān)系。Misharina T A 等人[11]對(duì)烹調(diào)后牛肝菌的風(fēng)味進(jìn)行檢測(cè)分析，表明加熱后風(fēng)味成分發(fā)生了顯著變化。但以食用菌為原料，進(jìn)行低鹽平衡發(fā)酵，其發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化動(dòng)態(tài)，尚無(wú)相關(guān)研究。

以牛肝菌、松茸菌、茶樹(shù)菇為原料，進(jìn)行低鹽發(fā)酵制備菌菇湯，并采用頂空- 固相微萃取法（Head Space-Solid Phase Microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS） 測(cè)定菌菇湯發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分，剖析發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味動(dòng)態(tài)變化，明晰菌菇湯獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)。以期為發(fā)酵食用菌復(fù)合調(diào)味料的風(fēng)味研究提供理論依據(jù)，促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肝菌（干制）、松茸菌（干制）、茶樹(shù)菇（干制）、木姜子（干制）、苦藠（新鮮）、食鹽、白砂糖市售，植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp. Plantarum，CICC 20718）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，CICC 6083），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC） 提供。

內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮（CAS 號(hào)108-94-1）、壬酸甲酯（CAS 號(hào) 1731-84-6），美國(guó) Sigma-Aldrich 公司提供；乙腈、甲醇、乙酸和三氟酸均為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 發(fā)酵菌菇湯制備

取粉碎后的黃牛肝菌、松茸菌、茶樹(shù)菇加水（食用菌∶水= 1∶10） 泡發(fā)5～6 h，加熱煮沸后冷卻，加入食鹽3%，白砂糖5%，木姜子0.5%，苦藠2%，接種0.1%復(fù)合發(fā)酵劑（植物乳桿菌植物亞種∶嗜酸乳桿菌= 1∶1），攪拌均勻后裝壇，采用經(jīng)煮沸冷卻的水封蓋，于32 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，分析不同發(fā)酵時(shí)間菌菇湯中揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化。

1.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

（1） 頂空固相微萃取。精確稱取菌菇湯樣品3.5 g，置于25 mL 固相微萃取儀采樣瓶中，加入2 μL 混標(biāo)（環(huán)己酮、壬酸甲酯），萃取溫度60 ℃。插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex 纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，頂空萃取45 min，熱解析5 min。

（2） 氣相色譜- 質(zhì)譜分析。參考解春芝[12]關(guān)于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定的方法進(jìn)行分析。色譜柱為HP-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm） 彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫40 ℃（保留4 min），以3 ℃/min 升溫至 160 ℃，以10 ℃/min 升溫至280 ℃，運(yùn)行時(shí)間50 min，汽化室溫度250 ℃，載氣為高純He（99.999%），柱前壓15.90 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時(shí)間1 min。離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 EV，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 565 V，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍29～500 amu。

（3） 定性與定量方法。通過(guò)對(duì)比Nist2017 和Wiley275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)進(jìn)行定性[13]。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮（2.053 4 μg/mL）、壬酸甲酯（0.788 0 μg/mL） 的質(zhì)量濃度、樣品中各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，對(duì)菌菇湯中各揮發(fā)性組分進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類分布

發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類分布見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類分布

風(fēng)味是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一，包括揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響尤為顯著[14-15]。采用頂空固相微萃取- 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS） 對(duì)菌菇湯發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。由圖1 可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類增多，未發(fā)酵的菌菇湯中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)66 種，經(jīng)7 d 發(fā)酵后，揮發(fā)性風(fēng)味的種類趨于穩(wěn)定，達(dá)到77 種，其中烯烴類種類最多，為26 種，其次為醇類（19 種），此外還包括醛類（9 種）、酮類（7 種）、酸類（6 種）、雜類（6 種）、酯類（4 種）。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中部分代謝產(chǎn)物屬于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[16]。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量的動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量的動(dòng)態(tài)變化

食品風(fēng)味品質(zhì)不僅取決于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類，在一定程度上，還與其含量的多少密切相關(guān)。由圖2 可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵，菌菇湯中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量也逐漸升高。菌菇湯發(fā)酵至第7 天，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量趨于穩(wěn)定，為76.41 mg/kg，與發(fā)酵9 d（79.74 mg/kg） 的總含量相當(dāng)。無(wú)論是否經(jīng)過(guò)發(fā)酵，含量最高的均為烯烴類，且隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，其含量也是逐漸升高。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的SPME-GC-MS 結(jié)果分析

發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的SPME-GC-MS 分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的SPME-GC-MS 分析結(jié)果

（續(xù)表1）

以環(huán)己酮和壬酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，對(duì)菌菇湯不同發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

由表1 可知，共檢測(cè)到92 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以烯烴類為主，為26 種，其次為醇類（19 種） 和醛類（16 種），還包括酸類（6 種）、酯類（7 種）、酮類（7 種）、雜類（7 種）。經(jīng)7 d 發(fā)酵后，菌菇湯揮發(fā)性風(fēng)味的種類和含量均趨于穩(wěn)定。因此，7 d 為菌菇湯的最佳發(fā)酵時(shí)間。其中，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類由66 種（未發(fā)酵） 上升至77 種（7 d），總含量由60.19 mg/kg（未發(fā)酵） 上升至 76.41 mg/kg（7 d），含量較高的主要有檸檬烯（30.18 mg/kg）、月桂烯（11.15 mg/kg）、6 - 甲基 - 5 - 庚烯 - 2 - 酮 （7.45 mg/kg）、乙酸 （3.16 mg/kg）、α - 蒎烯 （2.82）、癸酸（2.28 mg/kg）、β - 蒎烯 （2.31）、莰烯 （2.10）、1 -辛烯- 3 - 醇（1.91 mg/kg）。相較于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量很低，但其是感官品質(zhì)最重要的指標(biāo)之一，大部分揮發(fā)性物質(zhì)具有特殊的香氣，能夠賦予菌菇湯更加協(xié)調(diào)和多元化的獨(dú)特風(fēng)味。

烯烴類物質(zhì)共檢測(cè)到26 種，與飽和烴類相比，烯烴類物質(zhì)中的萜烯類化合物閾值較低，具有花香、果香味，對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[17-18]。菌菇湯中烯烴類物質(zhì)種類和含量均是最高的，含量較高的烯烴類物質(zhì)主要有檸檬烯、月桂烯、α - 蒎烯、莰烯、β - 蒎烯。發(fā)酵7 d 后，菌菇湯中烯烴類物質(zhì)總含量為52.26 mg/kg，其中檸檬烯和月桂烯的含量分別達(dá)到30.18 mg/kg 和11.15 mg/kg。檸檬烯具有橙皮清香，而月桂烯具有令人愉快的、清淡的香脂氣味[19]。

醇類物質(zhì)種類僅次于烯烴類，為19 種，多為脂質(zhì)氧化或羰基化合物還原生成的，通常具有芳香、植物香、酸敗味和土腥味，因其自身的閾值對(duì)食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)很小，但某些不飽和醇類卻是食品香氣的重要組成部分[19]。醇類以1 - 辛烯- 3 - 醇和桉葉油醇含量最為豐富，發(fā)酵7 d 后，分別為1.91 mg/kg和1.04 mg/kg。有研究表明，八碳化合物是食用菌中最重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[20]，1 - 辛烯- 3 - 醇是八碳化合物的代表，存在于大多數(shù)食用菌中，且含量較高，被譽(yù)為“蘑菇醇”，是由亞油酸經(jīng)脂肪氧化酶催化轉(zhuǎn)變形成，具有典型的蘑菇香[21]。李燕平[22]以巴山美味牛肝菌為研究對(duì)象，通過(guò)GC-MS 分析氣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)1 - 辛烯- 3 - 醇相對(duì)含量最高，達(dá)21.39%。王慧清等人[23]在松茸菌湯中共檢測(cè)出28 種香氣成分，其中1 - 辛烯- 3 - 醇占比達(dá)37.52%。

醛類物質(zhì)共檢測(cè)到16 種，發(fā)酵7 d 后，菌菇湯中醛類總含量為1.63 mg/kg，雖然含量較低，但其閾值較低，具有清香和果香風(fēng)味，也是菌菇湯香氣的重要組成部分[24]，主要由脂質(zhì)的氧化或氨基酸的降解生成[25]。酸類物質(zhì)共有6 種，包括乙酸、苯甲酸、辛酸、癸酸、香葉酸、月桂酸，總含量為5.93 mg/kg。酸類物質(zhì)不僅可賦予食品酸味，還是合成酯類的前體物質(zhì)之一[12]。酯類、酮類及雜類均為7 種，其中酯類包括癸酸甲酯、辛酸乙酯、月桂酸甲酯、十三烷酸甲酯、月桂酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、十六酸乙酯；酮類包括6 - 甲基- 5 - 庚烯- 2 - 酮、2 -壬酮、反式6 - 甲基- 3,5 - 庚二烯- 2 - 酮、香芹酮、胡椒酮、2 - 十一酮、胡椒烯酮；雜類包括2,4 -二甲基噻吩、1,3 - 二噻烷、二甲基三硫、p - 傘花烴、異丙基甲苯、茴香腦、螺[4.5]癸烷。酯類物質(zhì)是食品香氣的主要成分，除賦予食品特殊的“花果香味”外，還可掩蓋游離脂肪酸帶來(lái)的“不愉快刺激味”[26]。酮類可能源于醇的氧化反應(yīng)或酯類的分解反應(yīng)，多數(shù)酮類物質(zhì)閾值較高，對(duì)風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)不太大，有些酮類是形成雜環(huán)化合物的重要中間體，對(duì)香味的形成具有重要作用[27]。吡嗪類化合物閾值較低，普遍帶有令人愉悅的堅(jiān)果、燒烤香，對(duì)牛肝菌特征風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)[28]。發(fā)酵可以增加低鹽菌菇湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，使其風(fēng)味更加濃郁。各種風(fēng)味物質(zhì)共同作用，賦予低鹽發(fā)酵菌菇湯獨(dú)特風(fēng)味[29-30]。

3 結(jié)論

采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 技術(shù)，測(cè)定菌菇湯發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，明晰菌菇湯獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)。低鹽發(fā)酵菌菇湯中共檢測(cè)到92 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以烯烴類（26 種） 為主，其次為醇類（19 種） 和醛類（16 種）。經(jīng)7 d 發(fā)酵后，揮發(fā)性風(fēng)味的種類和含量均趨于穩(wěn)定，其中，種類由66 種（未發(fā)酵） 上升至77 種（7 d），總含量由60.19 mg/kg（未發(fā)酵） 上升至 76.41 mg/kg（7 d）。表明發(fā)酵可以增加低鹽菌菇湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，使其風(fēng)味更加濃郁。該研究結(jié)果可為低鹽發(fā)酵食用菌復(fù)合調(diào)味料的風(fēng)味研究提供理論依據(jù)，促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。