王建芳，曹 讓，辛清婷，蔣亞輝，楊培志

（西北農(nóng)林科技大學草業(yè)與草原學院, 陜西 楊凌 712100）

蒲公英(Taraxacum mongolicum)是菊科多年生草本植物，屬于國家中草藥保護品種之一，也是國家衛(wèi)計委公布的藥食同源的材料之一。研究表明，蒲公英不僅含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、多種維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還富含多酚類、多糖類、甾醇類、萜類等多種功能性成分，呈現(xiàn)出抗氧化、抗衰老、抗炎抗菌、提高機體免疫力等功效[1-3]。因此，蒲公英在我國許多地方都有不同規(guī)模的人工種植，作為蔬菜或被加工成各種保健食品。蒲公英的根系能夠在地下生長多年，富集和貯存更多的功能活性物質(zhì)，是很好的中藥材，我國民間自古就有人用蒲公英根泡水或泡酒喝的習慣，具有強身健體、延年益壽的功效。蒲公英根提取物具有較好的抗氧化作用[4-6]，但目前國內(nèi)外對蒲公英根的研究和開發(fā)利用仍相對較少。筆者運用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法對蒲公英根的乙醇提取物進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，其中含有豐富的多酚類物質(zhì)以及蒲公英甾醇等抗氧化活性成分。

自20 世紀80 年代以來，中國油菜(Brassica napus)種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位，菜籽油也成為我國居民最主要的食用油之一。食用油脂在日常食用和貯存過程中，常常會受到環(huán)境中光、熱、濕以及微生物等的影響而產(chǎn)生過氧化和酸敗等問題，嚴重影響油脂的品質(zhì)和食用安全性。為此，我國食用油標準(GB2760-2014) 允許添加一定劑量的抗氧化劑，常用的有丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基對苯二酚(TBHQ) 等食品添加劑。這些人工合成的化學添加劑雖然表現(xiàn)出了較好的抗氧化效果，但是研究發(fā)現(xiàn)，這類物質(zhì)對人體多臟器具有毒害性，甚至具有潛在致癌風險[7-8]。因此尋找綠色天然抗氧化添加劑已成為食品科技領域的熱門課題[9-11]。而植物多酚類物質(zhì)因同時具有抗氧化作用和抗炎、抗衰及預防心腦血管疾病等保健功能[12]，近年來更多地受到關注。

基于此，本研究將蒲公英根提取物以不同質(zhì)量分數(shù)添加到成品菜籽油中，采用Schaal 烘箱加速氧化法[10]，通過油脂過氧化值(POV)、酸價(AV)、硫代巴比妥酸(TBA)值等過氧化指標的變化，結合觀察油脂外觀和氣味的變化，并與常用的市售油脂抗氧化劑進行比較，考察蒲公英根提取物對食用油的抗氧化效果，旨在探尋一種更加安全有效的天然食用油抗氧化劑，同時為蒲公英根的開發(fā)利用拓展新的領域和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英：西北農(nóng)林科技大學草業(yè)科學系試驗田繁育種植的蒲公英。菜籽油：陜西眉縣菜籽油廠生產(chǎn)的物理壓榨成品菜籽油，未加入任何食品添加劑。食用油抗氧化劑：市售食品級BHA、BHT 及維生素E 油(VE)。標準品及試劑：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、蒲公英甾醇等均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的標準品；甲醇、乙腈、異丙醇等均為市售色譜純試劑；乙醇、無水乙醚、冰乙酸、異丙醇、三氯甲烷、碘、碘化鉀、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)等均為市售分析純試劑。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(Thermo Ultimate 3000)，配有Chameleon7 色譜工作站；高速冷凍離心機(Eppendorf 5424R)；真空旋轉蒸發(fā)儀(BUCHI R-215)；紫外可見分光光度計(島津UVmini-1280)；集熱式恒溫磁力攪拌水浴器(DF-101S) 及索氏提取裝置；恒溫鼓風干燥箱；超微粉碎機；萬分之一分析天平等。

1.3 試驗方法

1.3.1蒲公英根提取物的制備

采挖生長3 年的蒲公英根，洗去泥土，切片(段)，于恒溫鼓風干燥箱中60 ℃烘干，用超微粉碎機粉碎至可過0.178 mm 篩，稱取適量，濾紙包好，采用索氏提取法，以95%乙醇抽提4 h，然后將提取液經(jīng)減壓旋轉蒸發(fā)濃縮至無溶劑，得到蒲公英根提取物(以下簡稱提取物)，計算平均得率，并測定其相關的理化指標。最后密閉保存在0～4 ℃冰箱備用。

1.3.2 提取物中抗氧化活性成分檢測

參考國家藥典及相關文獻中相應物質(zhì)的檢測方法[13-15]，將以上制備的蒲公英根提取物及綠原酸、咖啡酸、蒲公英甾醇等標準品分別精密配制成400 μg·mL-1的溶液，并根據(jù)儀器響應值配置成一定比例的混合標準品溶液，利用高效液相色譜儀對提取物中的主要抗氧化活性成分進行分離檢測。

多酚類物質(zhì)檢測的色譜條件。色譜柱：BDS Hypersil C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇 ∶0.4%磷酸(40 ∶ 60)，等度洗脫，流速0.8 mL·min-1；運行時間15 min；柱溫35 ℃；紫外檢測器檢測波長327 nm；進樣量2 μL。“一測多評法”[16]同時檢測提取物中綠原酸、咖啡酸和總黃酮等多酚類物質(zhì)的含量。

甾醇類物質(zhì)檢測的色譜條件。色譜柱：BDS Hypersil C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇 ∶異丙醇(75 ∶ 25)，等度洗脫，流速1.0 mL·min-1；運行時間13 min；柱溫30 ℃；紫外檢測器檢測波長205 nm；進樣量15 μL。檢測提取物中甾醇類物質(zhì)的含量。

1.3.3 油脂抗氧化試驗

不同質(zhì)量分數(shù)的提取物添加，對菜籽油的抗氧化效果。精密稱取0.01、0.02、0.03 g 的提取物分別添加到100 g 純菜籽油中，充分攪拌溶解后，敞口置于(65 ± 1) ℃的恒溫鼓風干燥箱中，每周(即第0、7、14、21、28 及35 天) 分 別 取 樣 測 定POV、AV、TBA 值等指標，并觀察其外觀及氣味的變化情況。同時設置不添加提取物作為空白對照(CK)。

相同質(zhì)量分數(shù)的不同抗氧化劑添加，對菜籽油的抗氧化效果。按照國家標準規(guī)定，BHA、BHT 允許添加量為0.2‰，故精密稱取0.02 g 的BHA、BHT、提取物和VE 油分別添加到100 g 純菜籽油中，充分攪拌溶解后，敞口置于(65 ± 1) ℃的恒溫鼓風干燥箱中，每周(即第0、7、14、21、28 及35 天)分別取樣測定各油樣的過氧化值(POV)、酸價(AV)、硫代巴比妥酸(TBA)值等指標，并觀察其外觀及氣味的變化情況。同時設置不添加抗氧化劑作為空白對照組(CK)。

1.3.4 抗氧化指標的測定

POV 的測定與計算是依據(jù)GB 5009.227-2016 食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》第一法[17]進行，按照要求根據(jù)樣品性質(zhì)稍作調(diào)整。最后以1 kg油樣中活性氧的毫摩爾數(shù)表示POV。

AV 的測定與計算：依據(jù)GB5009.229-2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》第一法[18]進行，按照要求根據(jù)樣品性質(zhì)稍作調(diào)整。以1 g 油樣中酸性物質(zhì)可中和氫氧化鉀的毫克數(shù)表示AV 值。

TBA 值的測定與計算：按照GB/T35252-2017《動植物油脂2-硫代巴比妥酸值的測定》直接法[19]進行，按要求根據(jù)樣品性質(zhì)稍作調(diào)整。最后以1 g 油樣與TBA 試劑反應所測得吸光度值表示TBA 值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

提取物中活性成分檢測由Chameleon7 色譜工作站給出色譜圖及其定量分析結果；油樣各抗氧化指標分別進行3 次獨立重復測定，結果以平均值 ±標準誤表示，采用Excel 2013 對數(shù)據(jù)進行計算及作圖分析，采用SPSS 20 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蒲公英根提取物的性狀

蒲公英根經(jīng)過粉碎、提取并濃縮后，得到一種略具清香氣味兒的琥珀色油狀浸膏，平均得率為13.25%，測得其相對密度1.103 g·mL-1(20 ℃)；試驗顯示，這種與植物油色澤狀態(tài)接近的提取物，以0.5‰以下的劑量添加，經(jīng)充分攪拌后可與菜籽油互溶，對菜籽油的外觀、色澤及氣味等無不良影響。

2.2 提取物中抗氧化活性成分的檢測結果

多酚類物質(zhì)的 HPLC 檢測結果如圖1 所示，提取物中含有大量的多酚類物質(zhì)，共識別出5 種組分，其相對峰面積分別為綠原酸25.77%、咖啡酸22.60%、異綠原酸A 18.23%、黃酮1.09%、異綠原酸C 5.49%；甾醇類物質(zhì)的HPLC 檢測結果如圖2 所示，提取物中含有一定量的蒲公英甾醇，其相對峰面積13.28%。

圖1 提取物中多酚類物質(zhì)檢測色譜圖Figure 1 Chromatogram of polyphenols in extract

圖2 提取物中甾醇類物質(zhì)檢測色譜圖Figure 2 Chromatogram of sterols in extract

經(jīng)以上高效液相色譜分析，明確了蒲公英根提取物中含有酚酸類、黃酮類及甾醇類等多種具有抗氧化活性的還原性物質(zhì)，各組分的HPLC 定量結果為綠原酸17.72 mg·g-1，咖啡酸6.90 mg·g-1，異綠原酸A 10.06 mg·g-1, 異綠原酸C 3.51 mg·g-1，總黃酮2.70 mg·g-1，蒲公英甾醇8.22 mg·g-1。其中含量最高的為綠原酸，其次為異綠原酸A 和蒲公英甾醇。

2.3 油脂抗氧化試驗結果

2.3.1 不同的提取物添加量對菜籽油的抗氧化效果

分別添加了0.1‰、0.2‰及0.3‰提取物的處理組和零添加的空白對照組，各項過氧化指標在前兩周變化都不明顯，至21 d 左右各組各項指標均開始上升，上升幅度有所不相同(表1)。28 d 后，各處理組的POV、TBA 值和AV 值基本顯著低于空白對照組(P＜ 0.05)，且隨添加量的增加抗氧化效果明顯增強。說明一定質(zhì)量分數(shù)的提取物添加對菜籽油各項過氧化指標的上升具有很好的抑制作用，且呈現(xiàn)顯著的量效關系。

表1 不同的提取物添加量對菜籽油抗氧化效果差異顯著性分析Table 1 Significance analysis of antioxidant effects of different doses of extract on rapeseed oil

2.3.2 相同添加量的不同抗氧化劑對菜籽油的抗氧化效果

分別添加了0.2‰的不同抗氧化劑的處理組和不添加的空白對照組，各項過氧化指標在前兩周變化都不明顯(表2)，21 d 左右開始逐漸上升，上升幅度各不相同。28 d 后，POV 值大小排序為CK ＞ VE ＞BHA ＞ 提取物 ＞ BHT，提取物和BHT 添加組顯著低于其他組(P＜ 0.05)，且二者差異不顯著(P＞ 0.05)；TBA 值大小排序為CK ＞ VE ＞ BHT ＞ 提取物 ＞ BHA，除VE 添加組和對照組無顯著差異，其他各添加組均顯著低于對照組，其中最低組BHA 和提取物添加組間無顯著差異；35 d 后，AV 值大小排序為CK ＞VE ＞ BHA ＞ BHT ＞ 提取物，除VE 添加組和對照組無顯著差異，其他各添加組均顯著低于對照組。以相同質(zhì)量分數(shù)0.2‰分別添加，提取物對菜籽油POV 值的抑制能力比BHA 和VE 強，較BHT 稍弱；對TBA 值的抑制能力比BHT 和VE 強，較BHA 稍弱；對酸價的抑制能力比BHA、BHT 和VE 都略強。

表2 相同添加量的不同抗氧化劑對菜籽油抗氧化效果差異顯著性分析Table 2 Significance analysis of antioxidant effects of different additives with the same dose on rapeseed oil

3 討論與結論

3.1 酸價的變化

本研究中，所有油樣的酸價變化在前期都表現(xiàn)得很平穩(wěn)，直到第28 天后才開始緩慢上升，直至35 d對照組才上升了38%，與其他指標相比，酸價的變化很小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能有兩方面的原因：一是由于在試驗過程中，烘箱環(huán)境只提供了溫度和流動空氣(氧氣)等促氧化條件，而缺少了濕度和微生物條件，因而減緩了油脂的酸??；二是因為本研究采買的菜籽油為新鮮壓榨，且未經(jīng)過精煉提取，保存了菜籽中原有的維生素和甾醇類等具有天然抗酸敗能力的物質(zhì)[20-21]，緩沖了油脂的酸敗。具體原因還有待于進一步觀察和研究。

3.2 VE 的抗氧化效果

維生素E 是人體必需的一種脂溶性維生素，在人體內(nèi)能清除自由基，延緩衰老，具有很好的抗氧化效果，因而常被用來作為食用油的抗氧化添加劑[9-11]，但在本研究中的抗氧化效果卻不顯著，這種情況，許騰[22]和孫逸雯等[23]之前也曾報道過。李甜甜等[24]研究認為，VE 在氧和自由基中長時間暴露，可能會生成一系列對油脂具有促氧化作用的產(chǎn)物，從而加速油脂的過氧化和酸敗進程；根據(jù)馬齊兵等[25]的檢測結果，未經(jīng)精煉的菜籽毛油中維生素E的含量高達427.4 mg·kg-1，這就意味著純物理壓榨菜籽油天然就含有豐富的維生素E，而試驗中再進行人工添加VE，其抗氧化效果就顯現(xiàn)不出來了，這可能是VE 在本研究中的抗氧化效果不顯著的另一個原因。由此看來，對于純壓榨菜籽油而言，無需再添加VE 作為其抗氧化劑。

3.3 蒲公英根提取物對菜籽油的抗氧化效果

本研究由蒲公英根中獲得一種琥珀色油狀提取物，經(jīng)高效液相色譜分析，其中含有豐富的多酚類及甾醇等抗氧化活性成分。多酚類物質(zhì)大多自身極易被氧化，可充當還原劑降低油脂中的含氧量，還能充當單線態(tài)氧抑制劑、金屬離子螯合劑、自由基清除劑等眾多角色抑制油脂的氧化劣變[26]，相比人工合成抗氧化劑只提供單一活性羥基基團，天然多酚類物質(zhì)可以提供較多的活性酚羥基，能形成較多的氫自由基，以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基，來抑制脂肪氧化的進行[27-28]，其中的綠原酸屬于較強的酚型抗氧化劑，研究表明，其抗氧化能力要強于對羥苯酚、阿魏酸、丁香酸、BHA 和VE 等[29]；而植物甾醇也是一類對人體非常有益的具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及調(diào)節(jié)激素和代謝等作用的物質(zhì)，廣泛存在于植物的種子、花和根系中[30]。李婧雯和包怡紅[4]也在蒲公英根中提取到甾醇。許騰[22]也曾研究報道過植物甾醇對食用油脂具有很好的抗氧化效果。此外，陸長梅等[31]曾檢測出蒲公英根中還含有Vc 及多種抗氧化酶(SOD、POD、CAT)等抗氧化活性成分。并且，有多項研究證實，多種抗氧化物質(zhì)共存時可以產(chǎn)生很好的協(xié)同抗氧化作用[32-33]。因此認為，本研究獲得的蒲公英根提取物是一種復合型天然抗氧化劑。

本研究表明，蒲公英根提取物對菜籽油具有顯著的抗氧化效果，且隨添加量的增加而增強(P＜0.05)；以相同質(zhì)量分數(shù)(0.2‰)添加，蒲公英根提取物對菜籽油過氧化值的抑制作用較BHA 和VE 強(P＜ 0.05)，對硫代巴比妥酸值的抑制作用較BHT和VE 強(P＜ 0.05)，對酸價的抑制作用較BHA、BHT和VE 都略強(P＞ 0.05)。進一步說明蒲公英根提取物作為食用油抗氧化劑不僅具有天然物質(zhì)基礎，而且具有良好的實際效果。

如果以蒲公英根為原材料，對其主要抗氧化活性成分進一步精準提取和分離純化，并根據(jù)各成分的抗氧化功效進行有機組合，再結合實際應用技術進行研究開發(fā)，將有望獲得一種綠色天然的新型食品抗氧化劑，以取代化學合成的抗氧化添加劑。