趙斯塵，王曉東，吳灝，彭維，陳曌，蘇薇薇，王永剛*（.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣州 5075；.廣州白云山花城藥業(yè)有限公司，廣州 50555）

南藥猴耳環(huán)[

Archidendron clypearia

（Jack）I.C.Nielsen]是豆科含羞草亞科猴耳環(huán)屬植物猴耳環(huán)的干燥葉，具有消炎鎮(zhèn)痛，抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant

staphylococcus aureus

，MRSA）、黃嘌呤氧化酶、流感病毒、

β

-淀粉樣聚集活性，治療上呼吸道感染、細(xì)菌性腸炎等多種藥理作用。猴耳環(huán)消炎片是由猴耳環(huán)提取制成的中藥制劑，已在臨床使用多年，現(xiàn)階段在《中國藥典》中僅對猴耳環(huán)消炎片的沒食子酸（不低于5.0%）、槲皮苷（不低于0.20%）含量進(jìn)行控制，無法全面反映猴耳環(huán)消炎片的質(zhì)量情況，及安全性、有效性。

中藥指紋圖譜是一種基于中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究、全面反映藥物化學(xué)信息的技術(shù)，建立猴耳環(huán)消炎片的指紋圖譜可較全面地反映猴耳環(huán)消炎片的化學(xué)信息。細(xì)菌耐藥是全球醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的問題，其中MRSA是一種臨床上常見的多重耐藥菌，威脅人類健康。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明猴耳環(huán)可降低MRSA的耐藥性。因此，本文首先基于高效液相色譜法（HPLC）構(gòu)建了猴耳環(huán)消炎片指紋圖譜，確證了14個(gè)共有峰的化學(xué)成分，然后以體外抑菌活性為指標(biāo)衡量藥物有效成分的抗菌效力。最后采用指紋譜效學(xué)分析技術(shù)，將其指紋圖譜與體外抑制MRSA的藥效相關(guān)聯(lián)，確定了猴耳環(huán)消炎片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為猴耳環(huán)消炎片的質(zhì)量控制提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo SCIENTIFIC液相色譜儀（包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫控制模塊、UV檢測器均為DIONEX Ultimate 3000）；SHIMADZU超 快速高效液相色譜儀（包括二元泵LC-20AD-XR，自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20AD-XR，柱溫控制模塊CTO-20A）；AB SCIEX高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（Triple TOF 5600＋）；超純水機(jī)（Millipore Simplicity，美國密里博公司）；精密移液器（德國Eppendorf公司）；Sartorius電子天平（十萬分之一，BP211D）；滅 菌 鍋（GR 60DA）；DensiCHEK Plus比 濁 儀（VITEK2）；恒溫培養(yǎng)箱（常州諾基儀器有限公 司）；C色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C、Waters Symmetry C、太瑋科技 JADE-PAK ODS-AQ）。

1.2 試藥

磷 酸（批 號：P1508038，HPLC級85%～90%，阿拉?。患姿幔ㄅ枺?001408600，UHPLC/MS，Sigma）；乙腈、甲醇（HPLC級，F(xiàn)isher Scientific）；肉湯培養(yǎng)基（OXOID）；無菌96孔板（康寧）；哥倫比亞血平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

沒食子酸（批號：C13O9C72105，純度≥98%）、楊梅苷（批號：D01031EA14，純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；表沒食子兒茶素（批號：MUST-21042810，純度：98.71%）、沒食子兒茶素（批號：MUST-21041804，純度：98.57%）、兒茶素（批號：DST210225，純度：98%）（成都德思特生物科技有限公司）；槲皮素（批號：3467，純度：99.3%）、槲皮苷（批號：5634，純度：98.0%）（NATURE STANDARD CO.，LTD.）；金絲桃苷（批號：11521-201809，純度：94.9%，中國食品藥品檢定研究院）；表兒茶素沒食子酸酯（批號：A1921031，純度≥98%，阿拉?。?。

猴耳環(huán)消炎片（17批，S1～S17）由廣州白云山花城藥業(yè)有限公司提供；MRSA（3株，SM1～M3）由中山大學(xué)附屬第一院臨床檢驗(yàn)科微生物檢驗(yàn)室鑒定并提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 猴耳環(huán)消炎片指紋圖譜的構(gòu)建

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取適量對照品，加75%甲醇制成每毫升含沒食子酸450 μg、金絲桃苷4 μg、表沒食子兒茶素15 μg、槲皮素5 μg、沒食子兒茶素15 μg、楊梅苷5 μg、兒茶素10 μg、表兒茶素沒食子酸酯10 μg、槲皮苷40 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取消炎片10片，除去薄膜衣，研細(xì)，精密稱取0.240 g，置25 mL量瓶中，用75%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，收集續(xù)濾液即得。

2.1.3 色譜條件 C色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫25℃，流速1.0 mL·min；流動(dòng)相為乙腈（A）和pH為2.00的磷酸溶液（B），梯度洗脫：0→10 min，5%～10%A，10→65 min，10%～25%A。檢測波長：0→5.5 min為240 nm，5.5→65 min為208 nm。

2.1.4 方法學(xué)考察

① 專屬性試驗(yàn)：取適量猴耳環(huán)消炎片、片劑輔料（淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂等按比例復(fù)配）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制樣分析。如圖1所示，溶劑75%甲醇和輔料對分析無干擾，專屬性較好。

圖1 猴耳環(huán)消炎片（S1）和輔料（S2）的指紋圖譜Fig 1 Fingerprints of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets（S1）and excipients（S2）

② 精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣分析6次。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012.1版》進(jìn)行相似度評價(jià)，以槲皮苷（12號峰）為參照峰（S峰），計(jì)算其他色譜峰的相對峰面積及其相對保留時(shí)間。結(jié)果6次指紋圖譜的相似度均為1.000，且14個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.030%～0.35%和0.84%～2.5%，表明儀器精密度滿足要求。③ 方法重復(fù)性：取猴耳環(huán)消炎片平行制備6份供試品溶液并分析，結(jié)果6次指紋圖譜的相似度均為1.000，且14個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.060%～0.45%和1.4%～3.6%，表明方法的重復(fù)性滿足要求。④ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于制備后 的0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h測定，結(jié)果10次指紋圖譜的相似度不低于0.999，14個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.21%～0.57%和1.8%～4.6%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。⑤ 耐用性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，以來自不同廠家的3種C色譜柱分析，不同色譜柱間指紋圖譜的相似度均為1.000，且14個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.060%～0.60%和0.90%～5.71%。表明Waters Symmetry C、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C、太瑋科技 JADE-PAK ODS-AQ 3種色譜柱均滿足分析要求。

2.1.5 猴耳環(huán)消炎片指紋圖譜共有峰的確證 收集猴耳環(huán)消炎片17批制備供試品溶液并分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012.1版》進(jìn)行相似度評價(jià)，以編號S1的指紋圖譜為參照譜，進(jìn)行峰匹配得到14個(gè)共有峰，17批指紋圖譜（見圖2）的相似度在0.927～0.995。通過對照品比較（見圖3），確證了1號峰為沒食子酸（CHO），2號峰為沒食子兒茶素（CHO），4號峰為表沒食子兒茶素（CHO），5號峰為兒茶素（CHO），9號峰為楊梅苷（CHO），10號峰為金絲桃苷（CHO），11號峰為表兒茶素沒食子酸酯（CHO），12號峰為槲皮苷（CHO），14號峰為槲皮素（CHO）；利用 LC-TOF /MS /MS技術(shù)手段，指證了 3號峰為木犀草苷（CHO）異構(gòu)體，6號峰為5，7，3'，4'，5'-五羥基黃烷（CHO），7、8號峰為EGCG（CHO）異構(gòu)體，13號峰為7-沒食子酰特利色黃烷（CHO）。

圖2 猴耳環(huán)消炎片（S1～S17）及其對照模式（R）的指紋圖譜疊加圖Fig 2 Stacking fingerprint of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets（S1～S17）and its comparison diagram（R）

圖3 猴耳環(huán)消炎片和混合對照品的指紋圖譜疊加圖Fig 3 Stacking fingerprint of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets and mixed reference

2.2 譜效學(xué)分析

2.2.1 猴耳環(huán)消炎片體外抑MRSA活性 菌株復(fù)蘇與傳代后，選取對數(shù)生長期的MRSA加入生理鹽水，調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬肕-H肉湯培養(yǎng)基稀釋100倍，精密移取50 μL于96孔板各孔中。將17批猴耳環(huán)消炎片和空白對照（輔料）分別用M-H肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，加50 μL 至上述含菌液的96孔板中，最終MRSA接種量約為1.0×10CFU·mL。將 96 孔板于37℃恒溫培養(yǎng)20 h，取澄清孔及其2倍、4倍、8倍濃度孔中溶液，于血瓊脂平板上劃線涂布。將血瓊脂平板于37℃培養(yǎng)24 h后，血瓊脂平板無菌落生長的濃度，即為最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，

MBC

），

MBC

結(jié)果如圖4所示（處理重復(fù)3次）。

圖4 17批猴耳環(huán)消炎片體外抑制MRSA活性的影響Fig 4 Inhibition of 17 batches of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets on MRSA in vitro

2.2.2 關(guān)聯(lián)分析

① 灰色關(guān)聯(lián)分析：灰色關(guān)聯(lián)分析法分析各成分對于體外抗MRSA活性的影響程度，以

MBC

平均值的倒數(shù)為因變量，14個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行初值化處理后作為自變量，進(jìn)行分析。針對14個(gè)評價(jià)項(xiàng)，關(guān)聯(lián)結(jié)果如表1所示，關(guān)聯(lián)度大于0.8的成分有12個(gè)，表明這12個(gè)成分與體外抑MRSA關(guān)聯(lián)度較高。

表1 猴耳環(huán)消炎片指紋圖譜共有峰與體外抗MRSA活性的關(guān)聯(lián)度
Tab 1 Correlation between common peaks in the fingerprints of antiphlogistic tablets and in vitro inhibition of MRSA

峰號 成分 關(guān)聯(lián)度值1 沒食子酸 0.968 12 槲皮苷 0.951 10 金絲桃苷 0.951 11 表兒茶素沒食子酸酯 0.932 5 兒茶素 0.926 14 槲皮素 0.900 9 楊梅苷 0.894 7 EGCG（C22H18O11）異構(gòu)體1 0.885 2 沒食子兒茶素 0.852 4 表沒食子兒茶素 0.842 13 7-沒食子酰特利色黃烷 0.830 3 木犀草苷異構(gòu)體（C21H20O11） 0.826 6 5，7，3'，4'，5'-五羥基黃烷（C15H14O6） 0.758 8 EGCG（C22H18O11）異構(gòu)體2 0.644

② 偏最小二乘回歸（partial least squares，PLS）：由于多元線性回歸中，14個(gè)共有峰多重共線性嚴(yán)重（方差膨脹因子大于10），因此使用PLS回歸，建立猴耳環(huán)消炎片的譜-效關(guān)系模型。PLS回歸以

MBC

平均值的倒數(shù)為因變量

Y

，將共有峰峰面積初值化處理后作為自變量

X

，研究多個(gè)自變量

X

對于因變量

Y

的影響關(guān)系。PLS回歸擬合方程為

Y

＝0.815＋2.223

X

－2.143

X

－0.422

X

＋2.285

X

＋0.612

X

－0.116

X

－2.937

X

＋0.233

X

－0.519

X

－0.616

X

＋0.208

X

＋0.912

X

＋2.369

X

－1.403

X

。用R方值、預(yù)測誤差均方根（the root of mean square error prediction，RMSEP）對擬合效果進(jìn)行評價(jià)，R方值為0.95，RMSEP值為0.038（見圖5），表明該模型擬合效果較好。PLS回歸方程以各自變量的系數(shù)值為權(quán)重系數(shù)反映各個(gè)自變量所對應(yīng)的化學(xué)成分的相對重要性（見圖6）。猴耳環(huán)PLS回歸方程中系數(shù)大于0.6的活性成分為沒食子酸（共有峰1）、7-沒食子酰特利色黃烷（共有峰13）、表沒食子兒茶素（共有峰4）、槲皮苷（共有峰12）和兒茶素（共有峰5）。

圖5 RMSEP評估的擬合圖Fig 5 Fitting diagram of RMSEP evaluation

圖6 PLS回歸方程系數(shù)值的柱狀圖Fig 6 Histogram of coefficients in PLS regression equation

③ 綜合分析：綜合灰色關(guān)聯(lián)分析及PLS回歸分析結(jié)果，繪制Venn圖（見圖7），表明沒食子酸、表沒食子兒茶素、槲皮苷、7-沒食子酰特利色黃烷、兒茶素是猴耳環(huán)消炎片抗MRSA的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖7 灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果和PLS回歸分析結(jié)果的Venn圖Fig 7 Venn diagram of analysis results of grey correlation and PLS regression

3 討論

中藥指紋圖譜技術(shù)涉及多種方法，其中HPLC分辨率高、靈敏度高、色譜柱可反復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，是中藥指紋圖譜的首選方法。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC指紋圖譜，方法準(zhǔn)確靈敏，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，指認(rèn)和確證了14個(gè)共有成分，占總峰面積的90%以上，可用于猴耳環(huán)消炎片的質(zhì)量控制。在此基礎(chǔ)上，以體外抑菌活性衡量藥物有效成分的抗菌效力，該方法操作簡便、條件易于控制，已廣泛應(yīng)用于新藥研究和指導(dǎo)臨床用藥。

中藥譜效學(xué)以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為依托，在指紋圖譜的基礎(chǔ)上對應(yīng)藥效結(jié)果進(jìn)行綜合分析。本文首先通過灰色關(guān)聯(lián)分析從共有成分中篩選灰色關(guān)聯(lián)度大于0.8的化學(xué)成分；然后通過PLS回歸分析篩選PLS回歸擬合方程中系數(shù)大于0.6的化學(xué)成分，最后綜合灰色關(guān)聯(lián)分析和PLS回歸分析，表明沒食子酸、7-沒食子酰特利色黃烷、兒茶素、槲皮苷、表沒食子兒茶素是主要藥效成分，這與文獻(xiàn)報(bào)道吻合。沒食子酸與兒茶素具有與不同化合物聯(lián)合增效的潛在應(yīng)用。Mehrzadi等研究表明沒食子酸（200 mg·kg）與槲皮素（75 mg·kg）聯(lián)合給藥治療博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠的療效顯著優(yōu)于單獨(dú)給藥。Qin等研究表明將兒茶素（128 μg·mL）和表兒茶素沒食子酸酯（16 μg·mL）聯(lián)合可顯著增強(qiáng)體外苯唑西林抗MRSA的作用。7-沒食子酰特利色黃烷為猴耳環(huán)的特有成分，是猴耳環(huán)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用的潛在成分。槲皮苷可通過抑制金黃色葡萄球菌Sortase A靶點(diǎn)影響細(xì)菌黏附。

據(jù)此，闡明了猴耳環(huán)消炎片體外抑MRSA的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究為猴耳環(huán)消炎片的質(zhì)量控制提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。