張瀟莉，楊娜，葛佳佳，朱懷軍，何駿，葛衛(wèi)紅，*（.南京中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學院，南京 0008；.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥學部，南京 0008）

類固醇激素是一類由膽固醇經(jīng)一系列酶催化代謝產(chǎn)生的脂溶性小分子化合物，主要包括性激素和皮質(zhì)激素。內(nèi)源性類固醇激素的變化在內(nèi)分泌疾病及相關代謝性疾病的篩查與診斷中具有重要參考價值，其精確定量分析對于臨床研究是十分必要的。目前，臨床常用檢測類固醇激素的方法主要是免疫分析法，但隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術的不斷發(fā)展，其因高通量、高靈敏度和高特異性，適用范圍廣、檢測周期短，并且具有同時定性定量分析多種激素的優(yōu)勢，已逐漸替代免疫分析方法，成為臨床檢測與疾病篩查及診斷中重要的新技術。

與血清、血漿樣本相比，尿液樣本可以被非侵入性地連續(xù)收集，患者更易接受，且尿液前處理相對簡單。尿液排泄作為人體排泄的重要途徑，尿液中涵蓋大量內(nèi)源性極性代謝產(chǎn)物。通過對尿液樣本進行定量，可提供一個較為完整的代謝概況。例如，24 h尿兒茶酚胺的結(jié)果可比血兒茶酚胺更加精準地反映交感神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)的功能。臨床診斷庫欣綜合征時，24 h尿游離皮質(zhì)醇能夠避免皮質(zhì)醇的瞬時變化，避免血中皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白濃度改變而影響皮質(zhì)醇測定結(jié)果，且在大劑量地塞米松抑制試驗中24 h尿游離皮質(zhì)醇對庫欣綜合征診斷的靈敏度和特異性都高于血皮質(zhì)醇。5-羥吲哚乙酸的定量檢測可用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的監(jiān)測和診斷，雖然其可以在血樣中被定量分析，但臨床通常采用尿液樣本進行檢測。因此，利用LC-MS/MS技術檢測尿液樣本中的內(nèi)源性物質(zhì)具有一定優(yōu)勢，且已成為臨床檢測的一個重要方向。本文主要就LC-MS/MS技術在尿液類固醇激素測定中的研究及臨床應用進行綜述。

1 基于LC-MS/MS技術的尿液類固醇激素定量方法的研究現(xiàn)狀

LC-MS/MS技術是一種結(jié)合液相色譜與質(zhì)譜的定性和定量的分析技術。該技術具有液相色譜的高效分離性能和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高特異性檢測的特點，可實現(xiàn)多種成分的同時測定，適用于血清、尿液等復雜生物樣本的分析檢測。目前，利用LC-MS/MS技術在尿液中檢測內(nèi)源性類固醇激素正在迅速發(fā)展，其前處理不斷優(yōu)化，靈敏度不斷提高，檢測數(shù)量也逐漸增多。

尿液中涵蓋大量的內(nèi)源性極性代謝產(chǎn)物，在分析檢測前通常需要進行前處理以去除干擾性小分子。常用的前處理方法主要有蛋白質(zhì)沉淀法、液液萃取法和固相萃取法，但上述方法均存在操作時間長，處理步驟復雜等缺點。隨著尿液前處理方法的不斷優(yōu)化，出現(xiàn)并行樣品處理、柱交換和在線固相萃取等技術。這些技術可提高檢測靈敏度，增加檢測種類，縮短處理時間，提高效率且不影響檢測質(zhì)量，已在生物分析應用中獲得認可。例如Naldi等開發(fā)并驗證了一種基于全自動的在線固相萃取進行樣品提取和定量的LCMS/MS法，能同時檢測尿液和水樣中多種類固醇激素，分離分析只需10 min，節(jié)省大量時間并減少流程錯誤。Son等建立了一種新的LC-MS/MS方法，使用

β

-葡萄糖醛酸苷酶和固相萃取進行處理并提取，可用于檢測和分析尿液中的39種類固醇激素。

新色譜技術的應用促進了LC-MS/MS技術檢測類固醇激素的發(fā)展，例如超高效液相色譜法（UPLC）、整體色譜法及親水相互作用色譜法等，不僅能提供更高的靈敏度和分離效率，運行時間縮短，同時能最大限度地減少基質(zhì)效應。傳統(tǒng)色譜柱采用3 μm或5 μm的顆粒進行填充，而超高效液相色譜法的引入使高效小顆粒色譜柱應用于檢測，其通常填充＜2 μm的顆粒。與傳統(tǒng)色譜柱相比，高效小顆粒色譜柱能提供更高的穩(wěn)定性，減少溶劑使用量，增加靈敏度。如Zhou等采用UPLC-ESI-MS法同時檢測尿液樣本中14種類固醇激素，該方法經(jīng)過全面驗證，各激素提取回收率均大于87%，靈敏度更高。Dmitrieva等利用UPLC-HRMS技術檢測9種尿類固醇激素，采用分散液液微萃取法提取，該方法容易操作且不需大量有毒有機溶劑。

質(zhì)譜電離技術的發(fā)展可以提高LC-MS/MS技校檢測的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。其中大氣壓光化學電離技術作為大氣壓化學電離、電噴霧電離技術的補充，是更具有選擇性，在類固醇激素分析中展現(xiàn)出優(yōu)勢，能減少基質(zhì)效應、提高靈敏度，但電噴霧電離技術在檢測尿類固醇激素方面的應用更廣泛，其與三重四極桿儀相結(jié)合測定類固醇激素有著更高的靈敏度與特異性，且化學衍生化可以提高類固醇激素的電離效率，提高靈敏度，并有助于適合的監(jiān)測模式。如Berg等開發(fā)建立的LC-ESI-MS/MS法可檢測尿液中27種雌激素相關代謝物，該方法經(jīng)過驗證，定量檢測靈敏度可達到pg級。Dai等建立了新的LCESI-MS/MS法，使用氘4-（二甲氨基）-苯甲酸衍生化試劑，提高電離效率與檢測靈敏度，能檢測到24種尿類固醇激素。

綜上，樣品前處理的優(yōu)化，色譜條件的發(fā)展，靈敏準確的質(zhì)譜儀都在加快LC-MS/MS技術的發(fā)展，也使尿液類固醇激素的檢測有了更大的進步。這些應用均表明LC-MS/MS技術具有準確可靠的多分析物分析的潛力。

2 尿液類固醇激素檢測的臨床應用及研究進展

2.1 皮質(zhì)激素

皮質(zhì)激素來源于腎上腺皮質(zhì)，包括糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，其在許多生理過程中起到至關重要的作用。皮質(zhì)激素代謝的改變是引起鹽皮質(zhì)激素過多綜合征、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥和腎上腺功能不全的原因。研究發(fā)現(xiàn)，庫欣綜合征、多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能亢進、妊娠高血壓、先兆子癇及抑郁癥等疾病也與體內(nèi)這種改變有關。

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥是一種常染色體隱性疾病，體內(nèi)21羥化酶缺乏會導致皮質(zhì)醇和醛固酮合成受阻，兩者體內(nèi)代謝的改變引起疾病的發(fā)生。利用LC-MS/MS法對尿液中的皮質(zhì)醇及其代謝物進行定量分析，可有效降低診斷假陽性率，提高篩查診斷準確性。如Pussard 等建立的LC-MS/MS法成功檢測尿液中內(nèi)源性皮質(zhì)醇、雄激素及17-羥孕酮等，其結(jié)果可用于診斷先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥，并能應用于患者激素替代治療的定期監(jiān)測。Kosicka等利用新建立的LC-MS/MS法對尿皮質(zhì)醇和可的松及其代謝物進行定量，該方法經(jīng)過充分驗證，符合歐洲藥品管理局的要求，可用于先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、庫欣綜合征等臨床樣本的分析。

人體內(nèi)缺乏11

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-羥基類固醇脫氫酶，無法將皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)酮，導致皮質(zhì)醇在體內(nèi)蓄積而引起庫欣綜合征。24 h尿游離皮質(zhì)醇是皮質(zhì)醇綜合分泌的指標，也是庫欣綜合征的合理篩查標志物。靈敏準確的LC-MS/MS法檢測尿游離皮質(zhì)醇對于庫欣綜合征的篩查診斷十分有利。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，通過LC-MS/MS法測定的24 h尿游離皮質(zhì)醇在臨床實踐中具有優(yōu)越的診斷性能，其準確度與內(nèi)分泌學會指南建議的診斷方法的準確度相同，這表明測定24 h尿游離皮質(zhì)醇能夠更加方便準確地鑒別庫欣綜合征。例如，Ceccato等建立了標準化的LC-MS/MS分析方法測定尿液中游離皮質(zhì)醇的濃度，并評估該方法用于診斷庫欣綜合征的靈敏度及特異性，通過實驗得到了庫欣綜合征患者不同發(fā)病階段的皮質(zhì)醇水平參考范圍，該范圍為庫欣綜合征的對癥治療提供了一些參考。LC-MS/MS法可以避免免疫分析法檢測皮質(zhì)醇時的干擾問題。LC-MS/MS法在尿液中檢測皮質(zhì)醇的假陰性率較免疫分析法低，能更加方便、快速地獲得結(jié)果。Bianchi等利用LC-MS/MS法檢測庫欣綜合征患者的尿液樣本，其皮質(zhì)醇檢測結(jié)果能滿足臨床醫(yī)師對患者實驗室數(shù)據(jù)的要求，且準確度更高。因此，利用LC-MS/MS法檢測尿液皮質(zhì)激素在體內(nèi)水平的變化，對庫欣綜合征的篩查與診斷十分有利。慢性壓力和重度抑郁癥與皮質(zhì)醇代謝有關，為了更好地了解抑郁癥，Zhai等利用LC-MS/MS法定量分析健康成人和抑郁癥患者尿液中的5種皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇、可的松、四氫皮質(zhì)醇、異源四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松），結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素水平在抑郁癥患者中產(chǎn)生了顯著變化，并發(fā)現(xiàn)了患者體內(nèi)11

β

-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ型活性降低，5

α

-還原酶途徑出現(xiàn)功能障礙。體內(nèi)皮質(zhì)醇代謝的變化以及酶活性的改變?yōu)閷ふ乙钟舭Y的潛在病因提供了新的想法。多囊卵巢綜合征與雄激素和皮質(zhì)醇代謝物排泄增強以及5

α

-還原酶活性增加有關，皮質(zhì)激素生成增多是其重要的致病途徑。Cuzzola等基于新開發(fā)的LC-MS/MS法測定多囊卵巢綜合征患者的游離總糖皮質(zhì)激素，激素定量分析結(jié)果可用于支持與皮質(zhì)醇代謝相關病理的臨床診斷。

上述疾病均可以通過監(jiān)測皮質(zhì)醇、可的松及相關代謝物在體內(nèi)的水平變化來篩查診斷，因此利用靈敏、準確、高效的LC-MS/MS法用于檢測尿液皮質(zhì)激素水平變化，對先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、庫欣綜合征等疾病進行方便篩查、及早診斷與治療十分重要。

2.2 性激素

2.2.1 雌激素 雌激素是體內(nèi)常見的甾體類固醇激素，包括雌酮、雌二醇、雌三醇等，主要由卵巢產(chǎn)生，也可由雄激素經(jīng)芳香化轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。雌激素具有廣泛而重要的生理作用，不僅作用于女性生殖系統(tǒng)，而且對內(nèi)分泌、心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、皮膚及附屬物等均有明顯的影響。內(nèi)源性雌激素的定量分析在多種疾病的診斷治療中至關重要，包括女性生殖器模糊、多囊卵巢綜合征、卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌等。最近的研究發(fā)現(xiàn)雌激素及代謝物在女性盆底功能障礙性疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病），骨質(zhì)疏松等骨骼疾病以及糖尿病等疾病病因解釋中起到很大作用。

考慮到兒童和老年人體內(nèi)雌激素濃度較低，臨床診斷和流行病學研究都需要高靈敏度和高特異性的方法，且檢測樣本應具有方便采集、非侵入性特點，為此研究者們進行了一系列研究。例如，Coburn等利用LC-MS/MS法檢測血清、血漿和尿液中雌激素水平，該研究發(fā)現(xiàn)血清和尿液中雌激素及其代謝物測定值之間具有一致性，且單個代謝物的尿液濃度與血清濃度相關，并證明了尿液和血清中雌激素圖譜的一致性，結(jié)果證實尿液是流行病學研究中的一種適合替代物。Faupel等對比了LC-MS/MS法、放射性免疫分析法和酶相關免疫吸附劑檢測法測定尿液中雌激素及代謝物水平，其結(jié)果表明LC-MS/MS法更適合于測定絕經(jīng)后女性的雌激素及代謝物絕對或相對數(shù)量或水平變化，還能更全面地了解雌激素代謝物的特征。綜上，與血清相比，尿液中雌激素的濃度相對較高，并且其采集是無創(chuàng)性的，參與研究者更容易接受。因此，選擇尿液樣品測定雌激素及其代謝物具有明顯優(yōu)勢。

對雌激素及其代謝物進行定量分析對于闡明其致癌機制以及在子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的早期診斷、篩查、預防和治療領域的進一步應用具有重要意義。例如，Zhao等利用LC-MS/MS法檢測子宮內(nèi)膜癌患者與健康女性尿液中7種內(nèi)源性雌激素代謝物（2-羥基雌二醇、2-羥基雌酮、4-羥基雌二醇、4-羥基雌酮、16

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-羥基雌二酮、2-甲氧基雌二醇和2-甲氧基雌酮），發(fā)現(xiàn)與健康女性相比，子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)4-羥基雌二醇增多，2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌二醇減少，其中4-羥基雌二醇在體內(nèi)的高表達可能成為子宮內(nèi)膜癌高危人群的篩查指標。這為子宮內(nèi)膜癌患者尿液生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供了獨特的見解，為子宮內(nèi)膜癌的早期篩查提供了新的方法，該結(jié)果還需要廣大研究者進一步研究確認。

乳腺癌患者體內(nèi)雌激素代謝物同樣失衡。Berg等建立了一種新的LC-MS/MS法在極少量尿液中檢測27種雌激素及其代謝物，對該方法進行充分驗證后用于檢測乳腺癌患者的尿雌激素及代謝物濃度。結(jié)果表明內(nèi)源性雌激素代謝的不平衡與乳腺癌發(fā)展風險增加有關，這為臨床尋找評估乳腺癌風險的潛在生物標志物，盡快實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)和治療乳腺癌提供了新的思路。這些研究對于加快LC-MS/MS法應用于臨床檢測提供了更加令人信服的證據(jù)。闡明雌激素及其代謝物在體內(nèi)的變化特征對于上述疾病的臨床研究與診斷十分關鍵，因此，利用準確特異的LC-MS/MS法來評估體內(nèi)雌激素及代謝物濃度有利于及早發(fā)現(xiàn)各種疾病，進而進行積極有效的臨床干預。

2.2.2 雄激素 雄激素又稱為男性激素，包括睪酮、二氫睪酮、雄烯二酮等，主要是由睪丸合成和分泌，腎上腺和卵巢也分泌少量。其主要功能為促進男性性器官與精子發(fā)育成熟，促進蛋白質(zhì)合成，加快骨骼肌生長，抑制體內(nèi)脂肪增加等。人體內(nèi)雄激素代謝紊亂會引起肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病和骨質(zhì)疏松，也會增加心血管、腦血管（如中風和短暫性缺血發(fā)作）和動脈粥樣硬化等疾病的風險。監(jiān)測尿液雄激素代謝物水平變化對于研究激素替代療法對骨質(zhì)疏松癥和性腺功能減退的影響以及前列腺癌等癌癥早期預后的潛在生物標志物十分重要。

人體內(nèi)5

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-還原酶可催化睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮，當二氫睪酮在前列腺和皮膚內(nèi)積累到一定程度，會引起許多病理改變，如前列腺增生癥、痤瘡、女性多毛、男性脫發(fā)等。進一步明確雄激素水平變化與不同疾病之間的關系，有助于及早預防并對癥治療。例如，Im等通過監(jiān)測尿液內(nèi)源性雄激素濃度研究非那雄胺治療脫發(fā)的療效，其開發(fā)建立一種高靈敏度高特異性的LCMS/MS法，同時定量分析尿雄激素和前列腺素，并測定男性脫發(fā)組和正常對照組患者尿液中兩種激素的濃度差異，從而分析該藥物的治療效果。該定量分析方法在雄激素代謝相關的炎癥疾病中的應用也具有巨大潛力。

精確檢測內(nèi)源性雄激素有助于我們進一步了解并更好地治療代謝紊亂。對此，Wang等開發(fā)了同時量化尿液中15種類固醇激素葡萄糖醛酸苷的LC-MS/MS法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿液中脫氫表雄酮排泄增加后，患者開始出現(xiàn)腎上腺功能亢進癥狀（如多毛、脫發(fā)、痤瘡、高血壓等），這一發(fā)現(xiàn)為腎上腺功能亢進的早期鑒別診斷提供了新的思路，加快了臨床尿液樣本檢測雄激素及其代謝物的進展，也為腎上腺功能亢進與多囊卵巢綜合征區(qū)分鑒別提供了思路。多囊卵巢綜合征患者體內(nèi)睪酮和孕酮增多，產(chǎn)生與腎上腺功能亢進相似癥狀，僅通過臨床癥狀無法準確鑒別，因此對疑似人群進行內(nèi)源性雄激素和孕激素定量檢測，有助于該疾病的鑒別診斷。利用LC-MS/MS技術對多囊卵巢綜合征患者尿液中睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮等雄激素進行定量能將多囊卵巢綜合征與其他疾病區(qū)分開，提高診斷準確性。

有研究表明，類固醇激素如硫酸和葡萄糖醛酸的結(jié)合形式，在尿液中的濃度要比血漿或血清中的更高。內(nèi)源性雄激素硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合物可作為控制興奮劑濫用的指標。因此，Strahm等開發(fā)了一種快速靈敏的LC-MS/MS法，用于同時分離和量化尿睪酮、還原膽烷醇酮及脫氫表雄酮等的硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合物，該方法適用于檢測運動員尿液中雄激素結(jié)合物，以檢驗其是否服用興奮劑。尿液的快速獲取與簡單處理縮短了獲知檢測結(jié)果的時間，因此，采用LC-MS/MS法檢測尿液中雄激素水平是大型賽事的最佳選擇。

3 總結(jié)與展望

目前，LC-MS/MS法已成為臨床實驗室用于臨床疾病診斷標志物測定的有力武器之一。深入了解人體內(nèi)源性類固醇激素的變化將有助于更好地篩查和診斷相關疾病。LC-MS/MS法因其高靈敏度和高特異性等特點，使同時監(jiān)測多種內(nèi)源性物質(zhì)成為可能，在多種內(nèi)分泌和代謝疾病的早期診斷和監(jiān)測中具有重要意義。利用準確特異的LC-MS/MS法檢測尿液樣本中類固醇激素能全面闡述其整體代謝輪廓，也使研究者們更加關注尿類固醇激素與臨床疾病的關聯(lián)。本文中提及的方法均經(jīng)過充分驗證，但較多研究在臨床相關疾病診療中的實際應用還需在大規(guī)模人群中驗證，且方法提供的參考價值等問題有待進一步確定。LC-MS/MS技術測定尿類固醇激素正在發(fā)展中，很多色譜、質(zhì)譜技術并未應用檢測，本綜述僅簡要介紹了近年來應用于檢測尿類固醇激素的方法。由于LC-MS/MS技術檢測尿液樣本中內(nèi)源性孕激素的研究極少，且未應用于臨床，因此本文并未涵蓋所有類固醇激素，尿液孕激素的檢測未過多闡述。相信隨著LC-MS/MS技術檢測尿液類固醇激素的不斷完善，研究者們將開發(fā)建立更多方法用于檢測尿液中的所有類固醇激素，為內(nèi)分泌及代謝相關疾病尋找潛在的生物標志物，加快LC-MS/MS技術檢測尿液類固醇激素在臨床中的應用。