高靈犀，張 妍，汪 文，張 騰

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

胃癌是世界上第五大最常見的癌癥[1]。75%以上的新診斷患者處于晚期，約有50%的晚期胃癌患者失去了手術(shù)機會[2]。放療在胃癌治療中具有重要作用，主要運用于術(shù)前新輔助化療及術(shù)后輔助化療[3-4]。然而胃癌的放療抵抗性及電離輻射的非特異性毒性限制了放療的應(yīng)用[5]。因此，研究有效、低毒的放療增敏劑十分迫切。植物化學物質(zhì)的低毒性和良好的抗癌作用使其成為研究放療增敏的新方向[6]。冬凌草甲素是一種天然的抗腫瘤二萜類化合物，可抑制癌細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡、侵襲、遷移等[7-8]，且能增強非小細胞肺癌放療敏感性[9]，但其作為胃癌放療增敏劑及其機制研究尚不充分。本研究通過冬凌草甲素聯(lián)合放療處理SGC7901細胞，檢測其對細胞增殖、周期、凋亡的影響，探究其增強人胃癌放療敏感性的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SGC7901人胃癌細胞(上海澳音生物)，冬凌草甲素(美國MedChemExpress)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(FBS，上海雙洳生物)，CCK-8檢測試劑盒(麥客生物)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物)，EdU細胞增殖試劑盒、細胞周期試劑盒(上海碧云天生物)，兔源Bcl-2抗體、兔源Apaf-1抗體、兔源Cytochrome C抗體(武漢ABclonal)、兔源Bax抗體、兔源Cleaved-caspase3抗體、鼠源β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑(上海翊圣生物)。

1.2 細胞培養(yǎng) SGC7901細胞采用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。

1.3 冬凌草甲素溶液的制備 冬凌草甲素粉末用二甲基亞砜(DMSO)稀釋制成濃度為10 mmol/L的儲存液，分裝并保存于-80℃冰箱。

1.4 CCK-8實驗 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，細胞貼壁后，用不同冬凌草甲素濃度(0、2、4、8、16 μmol/L)或不同放療劑量(0、2、4、6 Gy)處理，72 h后用CCK-8試劑檢測細胞活力。CCK-8試劑加入2 h后用酶標儀(Bio Tek Epoch2)在450 nm處測定各組的吸光度(OD)，將各組孔OD值減去空白孔OD值，各重復孔OD值取平均數(shù)。細胞存活率=(加藥細胞OD-空白OD)/(對照細胞OD-空白OD)×100%；抑制率=(對照細胞OD-加藥細胞OD)/(對照細胞OD-空白OD)×100%。

1.5 EdU細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，設(shè)置空白對照組、冬凌草甲素組(6 μmol/L)、放療組(4 Gy)、聯(lián)合組。聯(lián)合組的細胞在放療前先用冬凌草甲素預處理1 h。48 h后將2×EdU工作液等比例加入孔板的培養(yǎng)基中，繼續(xù)孵育2 h，去除培養(yǎng)液，室溫固定、通透，每孔加入50 μL Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，然后染核，用熒光倒置顯微鏡(Nikon Ti-U)觀察并拍攝圖像，Image J 1.51K軟件計數(shù)，計算細胞增殖率。

1.6 平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的細胞，分組如“1.5”。聯(lián)合組的細胞在放療前先用冬凌草甲素預處理1 h。細胞以800個/孔的密度接種于6孔板，孵育10～12 d。固定、染色、漂洗后自然晾干并拍攝圖像，Image J 1.51K軟件計數(shù)克隆團，計算實驗組與對照組的比值。

1.7 細胞周期實驗 取對數(shù)生長期的細胞，分組如“1.5”。聯(lián)合組的細胞在放療前先用冬凌草甲素預處理1 h。48 h后收集細胞，預冷PBS重懸并離心。用預冷70%乙醇吹打混勻，4℃固定30 min后離心，預冷PBS重懸并離心。每組加入0.5 mL碘化丙啶染色液重懸，37℃避光溫浴30 min，流式細胞儀(Beckman CytoFLEX)檢測細胞周期。

1.8 細胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期的細胞，分組如“1.5”。聯(lián)合組的細胞在放療前先用冬凌草甲素預處理1 h。72 h后收集細胞，預冷PBS洗滌2次。用400 μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC染色液并混勻，4℃避光孵育15 min，加入5 μL碘化丙啶染色液于4℃避光孵育5 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9 qPCR 取對數(shù)生長期的細胞，分組如前。聯(lián)合組的細胞在放療前先用冬凌草甲素預處理1 h。48 h后用Trizol試劑提取總RNA，合成cDNA，最后用qPCR儀(ABI QuantStudio 3)分析基因表達情況。所有數(shù)據(jù)歸一化到GAPDH表達。使用計算公式2-ΔΔCt計算相對基因表達水平。相關(guān)引物序列如表1所示。

表1 qPCR所用引物序列

1.10 Western blot實驗 取對數(shù)生長期的細胞，分組如前。聯(lián)合組的細胞在放療前先用冬凌草甲素預處理1 h。48 h后提取細胞總蛋白并用Bicinchoninic acid(BCA)法檢測濃度。蛋白(30 μg)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h，一抗在水平搖床上4℃孵育過夜。次日與二抗室溫孵育2 h。最后用ECL化學發(fā)光試劑和化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5500)檢測蛋白表達量，Image J 1.51K軟件分析灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素抑制人胃癌細胞增殖 不同放療劑量處理SGC-7901人胃癌細胞72 h，與空白對照組相比，放療組細胞活力均下降，并隨放療劑量升高而下降(P<0.05)。見圖1A。放療組的SGC-7901人胃癌細胞半數(shù)抑制劑量為4.70 Gy。不同濃度冬凌草甲素處理SGC-7901人胃癌細胞72 h后，與空白對照組相比，冬凌草甲素組細胞活力均下降，并隨藥物濃度升高而下降(P<0.01)。見圖1B。冬凌草甲素組的SGC-7901人胃癌細胞半數(shù)抑制濃度為8.67 μmol/L。

A.不同放療劑量對SGC-7901人胃癌細胞活力的影響。F=84.361，P<0.001；B.不同冬凌草甲素濃度對SGC-7901人胃癌細胞活力的影響。F=242.964，P<0.001。*P<0.05，**P<0.01 vs. NC。

2.2 冬凌草甲素增強人胃癌細胞的放療敏感性 SGC-7901人胃癌細胞經(jīng)冬凌草甲素(6 μmol/L)和(或)放療(4 Gy)處理后，平板克隆形成實驗結(jié)果顯示：冬凌草甲素組和放療組的細胞克隆形成能力較空白對照組下降(P<0.05);而聯(lián)合組的細胞克隆形成能力較放療組降低更顯著(P<0.05)。見圖2A。EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示：與空白對照組[(54.20±1.20)%]相比，冬凌草甲素組[(41.10±1.10)%]和放療組[(26.40±1.40)%]的細胞增殖率下降(P<0.05)，而聯(lián)合組的細胞增殖率[(18.65±1.35)%]低于放療組(P<0.05)。見圖2B。

A.平板克隆實驗檢測冬凌草甲素和(或)放療對細胞克隆形成能力的影響，F(xiàn)=123.975,P<0.001；B.EdU細胞增殖實驗熒光圖像及統(tǒng)計結(jié)果,F=154.860,P<0.001。NC為空白對照組；Ori為冬凌草甲素組；IR為放療組；IR+Ori為聯(lián)合組；*P<0.05 vs. NC；#P<0.05 vs. IR。

2.3 冬凌草甲素誘導SGC-7901人胃癌細胞的G2/M期阻滯 SGC-7901人胃癌細胞用冬凌草甲素(6 μmol/L)和(或)放療(4 Gy)處理，48 h后檢測細胞周期。結(jié)果顯示：與空白對照組[(5.75±0.03)%]相比，冬凌草甲素組[(10.83±0.59)%]和放療組[(13.25±0.49)%]G2/M期細胞比例升高(P<0.05)；而聯(lián)合組G2/M期細胞比例[(21.61±0.21)%]高于放療組(P<0.05)。見圖3。

流式細胞術(shù)檢測冬凌草甲素和(或)放療對人胃癌細胞周期的影響，F(xiàn)1=291.035,F2=22.553,F3=408.532,均P<0.01。*P<0.05 vs. NC；#P<0.05 vs. IR。NC為空白對照組；Ori為冬凌草甲素組；IR為放療組；IR+Ori為聯(lián)合組。

2.4 冬凌草甲素增強SGC-7901人胃癌細胞凋亡 SGC-7901人胃癌細胞用冬凌草甲素(6 μmol/L)和/或放療(4 Gy)處理，72 h后檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示：與空白對照組[(5.60±0.31)%]相比，冬凌草甲素組[(17.89±1.35)%]和放療組[(30.01±1.51)%]的細胞凋亡率升高(P<0.05)；而聯(lián)合組的細胞凋亡率[(50.73±2.69)%]高于放療組(P<0.05)。見圖4A。qPCR和Western blot結(jié)果顯示:與空白對照組相比，冬凌草甲素組和放療組的凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Bax、Cytochrome C、Cleaved-caspase3表達升高(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降(P<0.05)。聯(lián)合組的Apaf-1、Bax、Cytochrome C、Cleaved-caspase3表達升高較放療組更明顯(P<0.05);Bcl-2表達下降較放療組更顯著(P<0.05)。見圖4B、C。

A.流式細胞儀檢測人胃癌細胞凋亡圖像，F(xiàn)=258.505，P<0.001；B.qPCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達，F(xiàn)1=123.943，F(xiàn)2=40.731，F(xiàn)3=314.877，F(xiàn)4=82.319，F(xiàn)5=151.778，P<0.001；C.Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達，F(xiàn)1=109.544，F(xiàn)2=31.830，F(xiàn)3=247.234，F(xiàn)4=61.209，F(xiàn)5=117.249，P<0.001。*P<0.05 vs. NC；#P<0.05vs. IR。NC為空白對照組；Ori為冬凌草甲素組；IR為放療組；IR+Ori為聯(lián)合組。

3 討論

胃癌一直是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，患者5年生存率低于30%[10]。除了手術(shù)治療以外，放療是胃癌的主要治療方法之一，特別是中晚期胃癌[11]。臨床上常用放療與順鉑、紫杉醇等常規(guī)化療相結(jié)合來增加癌細胞死亡，但對提升放療敏感性收效微弱，且增加了對正常組織的毒性[12]。因此，研究新型放療增敏劑是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在肺癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥中均可發(fā)揮顯著抗癌作用[13-15]，冬凌草甲素在非小細胞肺癌中可通過增強DNA損傷達到放療增敏的效果[9]。然而，有關(guān)冬凌草甲素作為胃癌放療增敏劑的研究仍不充分，其潛在機制尚不清楚。本研究以人胃癌細胞SGC7901作為研究對象，探討了冬凌草甲素作為胃癌放療增敏劑的可能性及其潛在機制。

在本研究中，我們首先驗證了冬凌草甲素抑制SGC7901細胞增殖，且呈劑量依賴性。隨后我們進行了細胞平板克隆形成實驗和EdU細胞增殖實驗。結(jié)果顯示聯(lián)合組的細胞增殖抑制作用高于放療組，提示冬凌草甲素預處理可以提高SGC7901細胞對放療的敏感性。影響放療敏感性的主要因素有細胞凋亡、周期分布、缺氧、DNA損傷修復和信號通路的調(diào)節(jié)[12]。G2/M期是細胞周期中輻射最敏感的階段，因此可以誘導G2/M期阻滯的藥物是潛在的放療增敏劑。在本研究中，單獨使用冬凌草甲素處理使細胞周期阻滯在G2/M期，與以往報道相符合[16-17]。值得注意的是，聯(lián)合組的G2/M期較放療組增加，S期和G1期均略微減少。G2/M期的細胞對放療更為敏感，而G1、S期的細胞對放療相對耐受，因此冬凌草甲素對SGC7901細胞的放療增敏作用可能部分是由于細胞周期的G2/M期阻滯所致。

細胞凋亡是放療介導癌細胞死亡的主要形式之一[18]。放療增敏劑可通過誘導細胞凋亡來提高放療的療效[19]。在本研究中，細胞凋亡實驗結(jié)果顯示聯(lián)合組的細胞凋亡率明顯高于放療組。研究表明，冬凌草甲素可通過多種信號通路誘導癌細胞凋亡[20-21]。在細胞凋亡線粒體途徑中，Cytochrome C的釋放或抑制取決于Bcl-2和Bax之間的平衡。當?shù)蛲龃碳ぎa(chǎn)生，線粒體外膜滲透性增加，Cytochrome C釋放至胞質(zhì)，與Apaf-1相結(jié)合并激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導致細胞凋亡[22]。在本研究中，與放療組相比，聯(lián)合組的凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Cytochrome C、Bax、Cleaved-caspase3表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)。以上結(jié)果提示冬凌草甲素增強了放療誘導的細胞凋亡，線粒體凋亡途徑關(guān)鍵分子Cytochrome C在聯(lián)合組明顯升高，提示存在線粒體損傷。

綜上所述，冬凌草甲素可增強SGC7901人胃癌細胞的放療敏感性，其機制可能與誘導G2/M期阻滯，增強放療誘導的細胞凋亡有關(guān)，這為冬凌草甲素在放療增敏中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。未來仍需要更多的分子機制研究及動物實驗來進一步證實冬凌草甲素的放療增敏作用。