陳 康，張益奇，朱 凱，戴志遠*

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012 3 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034）

鱘魚（Acipenser sinensis）是大型巡回性淡水魚，我國現(xiàn)有9 個品種，是現(xiàn)存最古老的原始硬骨魚類。鱘魚生長迅速，營養(yǎng)豐富[1]。由鱘魚魚卵加工而成的魚子醬具有重要的經(jīng)濟和科研價值。近幾年我國鱘魚養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，已成為淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要魚種之一[2]。然而，鱘魚的主要經(jīng)濟價值在于其魚卵，而鱘魚肉作為魚子醬的主要副產(chǎn)物未得到充分的開發(fā)利用，常制成魚粉或寵物飼料，造成大量優(yōu)質魚肉蛋白和油脂的浪費，限制了鱘魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。

冷凍魚糜是魚體經(jīng)采肉、漂洗、脫水、精濾等加工工序制得的濃縮肌原纖維蛋白，以其為原料生產(chǎn)的魚丸、魚餅、魚腸、模擬蟹棒等各種魚糜制品，具有高蛋白、低脂肪、無骨刺等優(yōu)點，深受老年人和兒童的喜愛，市場占有率長期穩(wěn)定增長[4-5]。利用鱘魚肉制作冷凍魚糜可以進一步提升鱘魚的經(jīng)濟價值，減少魚肉資源的浪費。鱘魚屬于紅肉魚類，制成的冷凍魚糜在儲藏過程中易發(fā)生冷凍變性現(xiàn)象，需在制作過程中進行抑制[6]。本文以西伯利亞鱘魚肉為原料，研究經(jīng)漂洗的冷凍魚糜在凍藏過程中的品質變化，為鱘魚肉冷凍魚糜的凍藏保質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西伯利亞鱘魚，新昌縣鱘鰉生物科技有限公司；37 種脂肪酸甲酯標準品，美國Sigma-Aldrich公司；高純氮氣，杭州今工特種氣體有限公司；其它化學試劑均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890 B 氣相色譜儀，美國Agilent 儀器公司；SpectraMax 190 全波長酶標儀，美國Molecular Devices 公司；T-18 均質機，德國IKA 儀器有限公司；Lynx 4000 型高速冷凍離心機、Evolution 60s紫外分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific 公司；TMS-Pro 質構儀，美國FTC 儀器有限公司

1.3 方法

1.3.1 冷凍魚糜的制備[7]取規(guī)格相近的新鮮鱘魚【體長（69.25 ± 5.78）cm，體質量（19.91± 3.66）kg】，去頭、去尾去內臟后立即覆冰送至實驗室進行采肉。新鮮魚肉采集后，以4 倍魚質量的漂洗液進行不同方式的漂洗，每次漂洗時間30 min，漂洗過程中不停攪拌并保持漂洗液溫度在10 ℃以下。漂洗后的魚肉用20 目尼龍濾網(wǎng)離心脫水，使最終樣品的含水量為（78±1）%，成型后置于-18 ℃凍藏待測。S1：0.15% NaCl 漂洗一次；S2：冰水漂洗一次，再用0.15% NaCl 漂洗一次；S3：冰水漂洗2次，0.15% NaCl 漂洗一次。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取[8]準確稱取2.0 g 冷凍魚糜，加入20 mL 去離子水均質并離心。取沉淀加入20 mL 低鹽緩沖液 （50 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0）均質并離心。得到的沉淀加入20 mL 高鹽緩沖液 （0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0）均質后靜置提取1 h，離心取上清液既得鹽溶性蛋白。取8 mL 鹽溶性蛋白，加入32 mL 蒸餾水并離心，取沉淀用0.6 mol/L NaCl溶液溶解，再次離心取上清液，得到的肌原纖維蛋白溶液采用Bradford 法測定濃度，用0.6 mol/L NaCl 調整至4.0 mg/mL，用以進行蛋白質的性質測定。

整個提取過程需采用冰水浴保持0～4 ℃的提取環(huán)境，加入的去離子水及緩沖液需在4 ℃冰箱預冷后使用。離心過程采用的離心溫度為4 ℃，離心速度為10 000×g，離心時間為10 min。

1.3.3 Ca2＋-ATPase 活性的測定[8]取1 mL 蛋 白溶液，加至9 mL 反應液中形成反應體系（0.5 mol/L KCl，5 mmol/L CaCl2，1 mmol/L 三磷酸腺苷（ATP），25 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），該體系于30 ℃準確反應10 min 后，立即加入5 mL 15%的三氯乙酸終止反應，混合液10 000×g 離心5 min，測定上清液中的磷含量。以恒重后的磷酸二氫鉀為標準品制作無機磷酸鹽溶液的標準曲線，用于無機磷的定量分析。取上清液2 mL，加入3 mL 定磷劑 （V蒸餾水∶V20%抗壞血酸∶V3mol/L硫酸∶V3%硫酸鉬酸=3∶1∶1∶1），30 ℃發(fā)色30 min，于波長640 nm 處測定吸光度值（A）。空白組用0.6 mol/L KCl 替代。Ca2+-ATPase 活性用每毫克蛋白單位時間內產(chǎn)生的磷含量表示【μmol/（min·mg）】。

1.3.4 巰基含量的測定[9]取蛋白溶液1.0 mL，加入9.0 mL 的尿素緩沖溶液【8 mol/L 尿素，1%十二烷基硫酸鈉 （SDS），3 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0】，混合均勻后加入1.0 mL 0.1%的5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶液，震蕩后在40 ℃反應25 min，于波長412 nm 處測吸光度，用0.6 mol/L KCl 溶液同時做空白。巰基含量以10-5mol/g 表示，摩爾消光系數(shù)為13 600 L/（mol·cm）。

1.3.5 魚糜蛋白羰基含量測定[8]取1.0 mL 蛋白稀釋液，加入1.0 mL 濃度為10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼（DNPH），室溫避光反應60 min，每隔10 min 振蕩1 次。隨后加入1.0 mL 20%三氯乙酸終止反應，10 000×g 下離心5 min，棄去上清液。沉淀中加入1.0 mL 乙酸乙酯-乙醇混合液（V∶V=1∶1）洗滌沉淀3 次，去除殘留的DNPH。在沉淀中加入3.0 mL 鹽酸胍溶液（6 mol/L 鹽酸胍、2 mol/L HCl），37 ℃下保溫15 min，待沉淀溶解，10 000×g離心5 min，收集上清液波長370 nm 處測定吸光度值。羰基含量表示為nmol/mg，摩爾消光系數(shù)為22 000 L/（mol·cm）。

1.3.6 表面疏水性測定[10]取1.0 mL 蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL 溴酚藍，震蕩反應30 min后，4 000×g 離心5 min。稀釋10 倍后，測定波長595 nm 處的吸光度值，以溴酚藍的結合量作為表面疏水性值。

溴酚藍結合量（μg）=（A空白-A樣品）×200/A空白

1.3.7 硫代巴比妥酸反應值（TBARS）測定[11]取2.0 g 樣品研碎，加入20 mL 7.5%三氯乙酸，振蕩30 min，10 000×g 20 ℃離心10 min，取上清液5.0 mL，加入5.0 mL 0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸（TBA）溶液，于90 ℃保溫30 min，流水冷卻至室溫后5 000×g 離心，取上清液于波長532 nm 處測定吸光度，同時以7.5 g/mL 三氯乙酸作空白，以1，1，3，3-四乙氧基丙烷為丙二醛標準品，硫代巴比妥酸反應物（TBARS）值以單位樣品中丙二醛的含量表示（mg/kg）。

1.3.8 脂肪酸組成測定 參照Bligh 等[12]的方法。取4.0 g 魚肉完全絞碎，加入12 mL 氯仿-甲醇（V氯仿∶V甲醇=2∶1）混合液均質3 min，再超聲提取20 min，8 000×g 離心15 min 后，取下層氮吹得粗油脂。在提取油脂中加入5.0 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，于65 ℃水浴20 min，振搖至油滴消失并冷卻。加入0.6 mL 50%三氟化硼-甲醇溶液，于65 ℃水浴5 min，超聲提取10 min 后加入2.0 mL正己烷，振搖后用2.0 mL 飽和NaCl 淋洗，1 000×g離心取上層用無水硫酸鈉脫水，過濾待測。采用峰面積歸一化法分析各脂肪酸組分的相對含量。每組樣品重復測試3 次。

氣相色譜條件[13]：HP-INNOWAX 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.15 μm）；升溫程序：初溫50℃保持2 min，后以4 ℃/min 升至250 ℃，保持15 min；進樣口溫度為250 ℃，分流比40∶1，進樣量1 μL，載氣流速為0.65 mL/min。

1.3.9 魚糜制品質構特性[14]冷凍魚糜4 ℃半解凍后，加入2.5% NaCl 斬拌3 min，填充至折徑45 mm 的尼龍腸衣中，打扣制成50 mm 長的魚腸。魚腸置于45 ℃凝膠化60 min，再于90 ℃熟化30 min，熟化后立即置于冰水中冷卻30 min，將魚糜切成30 mm 厚的圓柱體用以進行質構測定。TPA方法測定魚糜制品的質構特性，采用5 mm 球形探頭，穿刺速度1 mm/s，形變量50%。凝膠強度（g·mm）以破斷力（g）與凹陷深度（mm）的乘積表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013 和SPSS 22 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 冷凍魚糜凍藏期內活性巰基、羰基、表面疏水鍵含量的變化

活性巰基、羰基、表面疏水鍵含量是蛋白質氧化的重要特征之一，直接反應蛋白質性質變化[15]。不同漂洗次數(shù)冷凍魚糜在凍藏期間的活性巰基、羰基、表面疏水鍵含量變化如表1所示。在90 d的凍藏期間，3 組冷凍魚糜的活性巰基含量都顯著下降，羰基和表面疏水鍵含量顯著上升。由表1可知，增加漂洗次數(shù)可以抑制冷凍魚糜在凍藏期間的活性巰基含量下降。冷凍魚糜活性巰基下降的主要原因是凍藏過程中肌原纖維蛋白發(fā)生結構變化，活性巰基氧化形成二硫鍵。相關研究表明[16]，漂洗工藝可以洗脫魚肉中含有的促蛋白變性的成分，如Ca2+、Mg2+等。同時，漂洗工藝可以有效去除魚肉中的色素、水溶性蛋白等，減少冷凍過程中肌原纖維蛋白的活性巰基基團暴露，抑制活性巰基的氧化。

隨著凍藏時間延長，冷凍魚糜中羰基含量都快速上升，而漂洗工藝可以顯著抑制這種變化。凍藏過程中，3 組冷凍魚糜羰基含量都從儲藏開始就呈線性上升趨勢，其中S1 組冷凍魚糜羰基含量上升較快，S3 組上升最慢。相關研究表明[17]，冷凍魚糜中羰基含量的增加會引起肌原纖維蛋白的聚集與破裂，進而改變肌原纖維蛋白的構象，導致蛋白性質變化以及功能性喪失。羥自由基、氧化多肽碎片以及脂質氧化產(chǎn)物都會導致蛋白質氨基酸殘基轉化為羰基。

由表1可知，冷凍魚糜在凍藏期間表面疏水鍵含量呈現(xiàn)不斷上升趨勢。15 d 開始，3 組冷凍魚糜表面疏水性呈現(xiàn)顯著差異趨勢。S1 組冷凍魚糜在凍藏15 d 后表面疏水性持續(xù)上升，而S2 組和S3 組增長趨勢較平緩。研究表明[18]，漂洗工藝可以減緩冷凍魚糜肌原纖維蛋白在凍藏過程中的氧化變性，這可能是由于漂洗過程既可以減少魚肉中易氧化的不飽和脂肪酸含量，又可以減少水溶性蛋白酶含量，防止肌原纖維蛋白的結構破壞。

表1 漂洗次數(shù)對冷凍魚糜凍藏期內活性巰基、羰基、表面疏水鍵含量的影響Table 1 Effect of rinsing times on the contents of active sulfhydryl，carbonyl group and surface hydrophobicity of surimi during frozen storage

（續(xù)表1）

2.2 冷凍魚糜凍藏期間Ca2+-ATPase 活性變化

Ca2+-ATPase 活性可以直接反應凍藏過程中肌原纖維蛋白活性的變化，同冷凍魚糜的凝膠強度呈正相關，也是體現(xiàn)冷凍魚糜質量特性的重要指標之一[19]。由圖1可知，隨著凍藏時間的增加，肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性下降，最終趨于平緩。凍藏初始階段，冷凍魚糜Ca2+-ATPase 活性隨著漂洗次數(shù)的增加而下降，這可能是由于漂洗后需要進行脫水處理，脫水過程中冰水同魚肉分離，魚肉溫度隨之上升，而肌原纖維蛋白在溫度升高時容易相互聚集形成大分子蛋白質，從而導致肌原纖維蛋白的活性下降。隨著凍藏時間的增加，S1組和S2 組冷凍魚糜Ca2+-ATPase 活性下降，于60 d 時基本失去活性，而S3 組冷凍魚糜在第60 天時還保持有一定的活性，這表明漂洗工藝可以有效保持冷凍魚糜在凍藏過程中的肌原纖維蛋白活性。

圖1 漂洗次數(shù)對凍藏期間冷凍魚糜Ca2+-ATPase活性的影響Fig.1 Effect of rinsing times on Ca2+-ATPase activity of surimi during frozen storage

2.3 冷凍魚糜凍藏期間鹽溶性蛋白含量的變化

由圖2可知，冷凍魚糜的鹽溶性蛋白含量隨著凍藏時間的增加而下降，表明凍藏過程會引起肌原纖維蛋白變性。漂洗工藝可以去除魚肉中的水溶性蛋白、色素及其它雜質，相對提高鹽溶性蛋白含量。隨著凍藏時間增加，S3 組冷凍魚糜的鹽溶性蛋白含量下降趨勢顯著高于S2 組冷凍魚糜，分別為36.85%和33.98%。這可能是由于S3 組冷凍魚糜鹽溶性蛋白含量提高，增加了其氧化變性的程度，并且冷凍過程形成的冰晶更容易對鹽溶性蛋白結構造成破壞。由此可知，過度的漂洗工藝反而會引起肌原纖維蛋白在凍藏過程中的損耗。

圖2 漂洗次數(shù)對凍藏期間冷凍魚糜鹽溶性蛋白的影響Fig.2 Effect of rinsing times on salt-soluble proteins of surimi frozen storage

2.4 冷凍魚糜凍藏期間脂質氧化狀態(tài)

由圖3可知，冷凍魚糜在凍藏期間TBARS 值不斷上升，凍藏起始階段，冷凍魚糜TBARS 值增加較為緩慢，從30 d 開始快速上升，S1 冷凍魚糜TBARS 值最高，S3 組最低。丙二醛是多不飽和脂肪在氧化過程中的產(chǎn)物，因此TBARS 值可以反映冷凍魚糜在凍藏期間脂肪的氧化情況。由圖3可知，隨著漂洗次數(shù)的增加，冷凍魚糜在凍藏期間的脂質氧化呈減緩趨勢。魚肉組織脂肪含量高，富含不飽和脂肪酸，在凍藏過程中易發(fā)生氧化作用，漂洗工藝可以顯著降低冷凍魚糜中的脂肪含量，避免了冷凍魚糜在凍藏過程中脂質的快速氧化。

圖3 漂洗次數(shù)對冷凍魚糜凍藏期間TBARS 值的影響Fig.3 Effect of rinsing times on TBARS value of surimi during frozen storage

2.5 冷凍魚糜凍藏期間脂肪組成的變化

圖4為不同漂洗次數(shù)冷凍魚糜在凍藏期間二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）相對含量的變化趨勢，由于DHA 和EPA 不飽和程度相似，因此變化趨勢基本相同。由圖4可知，3 組冷凍魚糜DHA 和EPA 的相對含量在凍藏期間都經(jīng)歷了先上升后下降的過程，結合TBARS 值可以推測這可能是由于冷凍魚糜在凍藏初期不帶有DHA 和EPA 的甘油酯先開始氧化，導致EPA 和DHA 相對含量增加，EPA 和DHA 于15 d 開始迅速氧化。由圖4a 可知，盡管S3 組冷凍魚糜初始DHA 相對含量較高，然而在儲藏過程中氧化速率高于其它兩組，自60 d 開始DHA 相對含量已低于其它兩組冷凍魚糜。由圖4b 可知，S3 組冷凍魚糜的EPA 相對含量一直保持較高的水平，然而隨著凍藏時間的增加，3 組冷凍魚糜的EPA 相對含量差異減少。由此可知，盡管不飽和脂肪酸在低溫條件下氧化速率降低，但在長時間的冷凍條件下，氧化程度也能積累到較高水平。因此，冷凍魚糜在凍藏過程中也應關注脂肪酸的氧化損失，尤其是在制作少漂洗冷凍魚糜過程中。

圖4 漂洗次數(shù)對凍藏期間冷凍魚糜DHA（a）和EPA（b）相對含量的影響Fig.4 Effects of rinsing times on the relative contents of DHA （a） and EPA （b） in surimi during frozen storage

2.6 冷凍魚糜凍藏期間質構特性變化

由圖5可以看出，初始的破斷力、凹陷深度和凝膠強度都隨著漂洗次數(shù)的增加而升高，在凍藏過程中隨時間延長而下降，逐步失去凝膠形成能力。S1 組冷凍魚糜在凍藏期間凝膠強度最低，并且在30 d 時基本失去了凝膠形成能力。S3 組冷凍魚糜雖在凍藏期間凝膠強度保持最好，但也于60 d 基本失去凝膠能力。相關研究表明[20]，冷凍魚糜在凍藏過程中肌原纖維蛋白會發(fā)生降解，而肌原纖維蛋白是魚糜凝膠形成的決定性因素。魏躍勝等[21]指出，淡水魚發(fā)生冷凍變性的程度遠遠高于海水魚。本研究所使用的鱘魚肉為淡水魚肉，在冷凍條件下更易發(fā)生冷凍變性，因此更需要添加抗凍成分延長其儲藏期。

圖5 漂洗次數(shù)對凍藏期間冷凍魚糜破斷力（a）、凹陷深度（b）和凝膠強度（c）的影響Fig.5 The influence of rinsing times on the breaking force （a），deformation （b） and gel strength （c）of surimi during frozen storage

3 結論

凍藏過程中冷凍魚糜的活性巰基和Ca2+-ATPase 快速下降、羰基和表面疏水性快速上升，表明凍藏過程中冷凍魚糜蛋白質發(fā)生氧化、空間結構發(fā)生變化導致內部疏水基團暴露，蛋白質活性降低，而漂洗工藝可以有效延長蛋白質的冷凍變性時間。凍藏過程中鱘魚魚糜的脂肪也在不斷氧化，TBARS 值自凍藏初始即快速上升，而漂洗工藝可以延緩脂肪酸的氧化。結合TBARS 值和氣相分析結果，發(fā)現(xiàn)凍藏初期DHA 和EPA 氧化程度相對較低，凍藏中期開始迅速氧化。質構分析進一步證明，漂洗工藝可以抑制凍藏過程中冷凍魚糜的蛋白結構劣化，因此在研究減少魚糜漂洗工藝時需關注其冷凍變性過程。