劉海波，冉俊楓，任艷*，田余波，吳發(fā)明，毛羽，茍琰，司丹丹

（1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院 民族藥物研究所，四川成都 610041）（2.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義 563000） （3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都 611731）（4.SCIEX中國，北京 100015）

爬沙蟲來源于廣翅目巨齒蛉屬Acanthacorydalis和部分大型齒蛉屬Neoneuromus的老熟幼蟲，主流物種之一為屬模巨齒蛉Acanthacorydalis asiatica（Wood-Mason）。其營養(yǎng)價值高，是川西南、滇東北等地區(qū)傳統(tǒng)的食、藥兩用滋補品[1,2]，同時爬沙蟲還是彝族、苗族、哈尼族、納西族治療小兒及老年人夜尿的特效民族藥[1]，具有溫陽止溺、祛風(fēng)濕等功效，用于小兒遺尿，老年人體虛夜尿，跌打損傷，風(fēng)濕痹痛等癥；現(xiàn)代研究表明，爬沙蟲可明顯降低水負荷多尿大鼠尿量，對腎陽虛大鼠腎臟具有明顯保護作用，還能顯著改善衰老大鼠的記憶力[3]，具有較高的藥用價值。

然而，目前對爬沙蟲的化學(xué)成分研究極少，僅報道其富含多種氨基酸、脂肪、有機酸、多糖等[4]，未見對其化學(xué)成分進行系統(tǒng)的分析，這直接制約了爬沙蟲的深入研究與開發(fā)應(yīng)用。調(diào)研表明，根據(jù)用途不同，爬沙蟲使用部位有所差異，在云南景谷、四川攀西等地區(qū)有常將爬沙蟲去頭、胸后食用，入藥則用全體，該食用或藥用部位的選擇方式尚缺乏科學(xué)依據(jù)[5,6]，因此亟需對爬沙蟲不同部位化學(xué)成分進行差異研究，為爬沙蟲的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及使用部位的選擇提供依據(jù)。

UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)具有靈敏度高、選擇性好、分辨率高的特點，可有效提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，是目前國內(nèi)外使用較為普遍的分析檢測手段，被廣泛應(yīng)用于天然藥物的成分分析與鑒定方面[7-10]。目前，針對液質(zhì)聯(lián)用識別出的化學(xué)成分，常以相對峰面積大小為相對含量指標(biāo)確定不同樣品的質(zhì)量差異，鮮見用HPLC進行定量驗證[11,12]。本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對爬沙蟲不同部位（頭、胸、腹，見圖1）化學(xué)成分進行定性鑒別，通過對照品、化合物精確分子質(zhì)量和碎片信息及參考文獻資料等手段鑒定化合物，利用多元統(tǒng)計分析篩選不同部位差異化合物，并進行含量測定，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及藥用部位的篩選提供依據(jù)。

圖1 爬沙蟲不同部位示意圖 Fig.1 The different parts of hellgrammites

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

爬沙蟲采于云南西雙版納，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院吳發(fā)明教授鑒定為屬模巨齒蛉Acanthacorydalis asiatica（Wood-Mason）的干燥幼蟲。

1.1.2 試劑

對照品D-山梨醇、苯丙氨酸、尿苷、煙酸、組氨酸、亞油酸、次黃嘌呤、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸，成都克洛瑪生物科技有限公司，批號分別為CHB190118、CHB180525、CHB180121、CHB180614、CHB181129、CHB180612、CHB180522、CHB180616、CHB180313、CHB190106；乙腈、甲酸、異硫氰酸苯酯均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LC-30A型超高效液相色譜儀，日本島津公司；Triple TOF 6600型四極桿串聯(lián)飛行時間高分辨質(zhì)譜儀，美國SCIEX公司；Agilent 1260 Infinity液相色譜儀，美國Agilent公司；JY92-IID型超聲波細胞粉碎機，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；CPA225D型十萬分之一分析天平，德國賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

1.2.1.1 爬沙蟲供試品溶液的制備

分別取爬沙蟲頭、胸、腹干品適量，粉碎后過100目篩，精密稱取1.0 g，置于100 mL試管中，加入75%乙醇50 mL，于超聲波細胞破碎儀中超聲處理30 min（功率600 W），取出，放冷，用75%乙醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.1.2 對照品溶液的制備

稱取適量D-山梨醇、苯丙氨酸、尿苷、煙酸、組氨酸、亞油酸、次黃嘌呤對照品于10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇定容至刻度，分別制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.1.3 色譜條件

質(zhì)譜負離子模式色譜條件：色譜柱為 Waters acquity BEH amide柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為25 mmol/L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B）洗脫梯度（0～2 min，95% B；2～18 min，95%～65% B；18～20 min，65%～40% B；20～22 min，40%～40% B；22～22.1 min，40%～95% B；22.1～30 min，95%～95% B），流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。

質(zhì)譜正離子模式色譜條件：色譜柱為 Waters acquity HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脫梯度：0～1.5 min，1% B；1.5～15 min，1%～99% B；15～20 min，99% B；20～21 min，99%～1% B；21～30 min，1% B；流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。

1.2.1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式，噴霧電壓（IS）為+5500 V，-4500 V；霧化氣壓力（GS1）為55 psi；氣簾氣壓力（CUR）為35 psi；輔助氣壓力（GS2）為55 psi；離子源溫度（TEMP）為550 ℃；簇裂解電壓（DP）為80 V；碰撞能量（CE）為35 V；碰撞能量滾動區(qū)間（CES）為15 V；檢測模式為信息關(guān)聯(lián)采集模式（IDA），多重質(zhì)量虧損（MMDF）和動態(tài)背景扣除（DBS）為觸發(fā)二級的條件，符合該條件優(yōu)先進行二級掃描。

1.2.2 HPLC測定差異化合物含量

1.2.2.1 供試品溶液制備

用于煙酸、次黃嘌呤含量測定的供試品制備方法同1.2.1.1。

用于纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量測定的供試品制備方法：精密吸取1.2.1.1下供試品溶液1 mL，置5 mL量瓶中，加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液600 μL及1 mol/L三乙胺乙腈溶液600 μL，混勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈水至刻度，隨后轉(zhuǎn)移至10 mL的EP管中，加入正己烷5 mL，振蕩，放置10 min，吸取下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.2 對照品溶液的制備

煙酸、次黃嘌呤混合對照品溶液：精密稱取煙酸10.95 mg，次黃嘌呤15.59 mg，加10%甲醇溶解并定容至100 mL，即得。

纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸混合對照品溶液：精密稱取纈氨酸12.85 mg、異亮氨酸10.62 mg、亮氨酸12.24 mg、苯丙氨酸11.66 mg，加50%甲醇溶解并定容至25 mL，即得混合對照品儲備溶液。精密吸取混合對照品儲備溶液1 mL，置5 mL量瓶中，加入0.10 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液600 μL及1 mol/L三乙胺乙腈溶液600 μL，混勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈水至刻度，隨后轉(zhuǎn)移至10 mL的EP管中，加入正己烷5 mL，振蕩，放置10 min，吸取下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.3 色譜條件

煙酸、次黃嘌呤含量測定：Agilent TC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測波長：262 nm；流動相：A相為甲醇，B相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液；梯度洗脫（0～5 min，99% B；5～15 min，98% B；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量測定：Agilent TC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：43 ℃；檢測波長：254 nm；流動相：A相為0.10 mol/L醋酸鈉（醋酸調(diào)pH至6.5）-乙腈（93:7），B相為乙腈-水（4:1），梯度洗脫（0～11 min，7% B；11～13 min，12% B；13～15 min，15% B；15～25 min，25% B；25～30 min，35% B；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用PeakView 2.0版本軟件對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進行處理，SIMCA 14.1進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）；采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進行單因素方差分析，顯著水平p為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 爬沙蟲不同部位化學(xué)成分分析

采用UHPLC-Q-TOF MS/MS在上述“1.2.1.3”項液相色譜條件和“1.2.1.4”項質(zhì)譜條件下對爬沙蟲樣品進行分析，獲得爬沙蟲不同部位的正、負離子模式全掃描總離子流圖（TIC），見圖2。將該數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView 2.0軟件，獲得滿足質(zhì)量誤差小于5×10-6，同位素分布正確的目標(biāo)化合物，通過對照品比對、參考相關(guān)文獻、數(shù)據(jù)庫匹配分析及二級碎片裂解規(guī)律，從爬沙蟲頭、胸、腹供試品溶液中共鑒定出25個化合物（見表1），頭、胸、腹分別鑒定出19、21、19個化合物，包括9種氨基酸類成分，6種有機酸類成分，5種核苷類成分，5個其他類成分。

圖2 爬沙蟲不同部位總離子流圖 Fig.2 The total ion chromatogram of different parts of hellgrammites

續(xù)表1

2.1.1 氨基酸類化合物的鑒定

在正、負離子模式下爬沙蟲頭、胸、腹中共檢測到9種氨基酸，其中脯氨酸、谷氨酸、色氨酸為首次報道。以脯氨酸和苯丙氨酸為例，正離子模式下，保留時間為0.99 min，一級質(zhì)譜獲得m/z116.07 [M+H]+的質(zhì)譜信號，二級質(zhì)譜分別出現(xiàn)70.07，68.05質(zhì)譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C5H9NO2，二級質(zhì)譜圖顯示準(zhǔn)分子離子峰豐度較低，易失去HCOOH形成穩(wěn)定的70.07 [M+H-HCOOH]+碎片離子，也可失去OH-CH3N形成68.05 [M-OH-CH3N]+碎片離子，結(jié)合文獻報道[13]，推測該化合物為脯氨酸。負離子模式下，保留時間為12.52，一級質(zhì)譜獲得m/z164.07 [M-H]-的質(zhì)譜信號，二級質(zhì)譜出現(xiàn)147.05，103.06，72.01質(zhì)譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C9H11NO2，主要的二級碎片離子為 147.05 [M-H-NH3]-，103.06 [M-NH3-COOH]-，72.01 [M-NH2-C6H5]-，經(jīng)對照品比對，推斷該化合物為苯丙氨酸，二級質(zhì)譜及可能的裂解途徑見圖3。

圖3 苯丙氨酸的二級質(zhì)譜圖（a），對照品的二級質(zhì)譜圖（b）及其裂解規(guī)律（c） Fig.3 Secondary mass spectrogram of phenylalanine (a), secondary mass spectrogram of reference (b), mass spectrometric fragmentation pattern of phenylalanine (c)

2.1.2 有機酸類化合物的鑒定

在正、負離子模式下爬沙蟲頭、胸、腹中共檢測到6種有機酸。以肉桂酸和煙酸為例，正離子模式下，保留時間為5.40 min，一級質(zhì)譜獲得m/z149.06 [M+H]+的質(zhì)譜信號，二級質(zhì)譜出現(xiàn)103.06，77.04質(zhì)譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C9H8O2，主要二級碎片離子為103.06 [M+H-HCOOH]+，77.04 [M-CH2= CH-COOH]+，推測該化合物為肉桂酸，二級質(zhì)譜及可能的裂解方式見圖4。負離子模式下，保留時間為10.16 min，一級質(zhì)譜獲得m/z122.02 [M-H]-的質(zhì)譜信號，二級質(zhì)譜出現(xiàn)78.04質(zhì)譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C6H5NO2，二級質(zhì)譜圖顯示準(zhǔn)分子離子峰豐度極低，易失去COOH形成穩(wěn)定的78.04 [M-COOH]-碎片離子，經(jīng)對照品比對，推斷該化合物為煙酸。

圖4 肉桂酸的二級質(zhì)譜圖（a）及裂解規(guī)律（b） Fig.4 Secondary mass spectrogram of cinnamic acid (a) and mass spectrometric fragmentation pattern of cinnamic acid (b)

2.1.3 核苷類化合物的鑒定

在爬沙蟲頭、胸、腹中共檢測到5種核苷類化合物。以次黃嘌呤和尿苷為例，正離子模式下，保留時間1.71 min，一級質(zhì)譜獲得m/z137.05 [M+H]+的質(zhì)譜信號，二級質(zhì)譜圖顯示準(zhǔn)分子離子峰豐度較高，二級碎片m/z120.02，119.04，110.04為準(zhǔn)分子離子分別失去1個NH3，H2O和HCN形成，與文獻報道相符[14]，故推斷該化合物為次黃嘌呤，本實驗發(fā)現(xiàn)，m/z110.04離子還可進一步在高能碰撞下失去一個CO形成m/z82.04子離子。負離子模式下，保留時間4.41 min，一級質(zhì)譜獲得m/z243.06 [M-H]-的質(zhì)譜信號，二級質(zhì)譜出現(xiàn)200.06 [M-H-CONH]-、152.03 [M-H-CONH-H2O-CH2-O]-、140.03 [M-H-CONH-C2H4O2]-、122.02 [M-H-CONH- C2H4O2-H2O]-、110.02 [M-H-C5H9O4]-、82.03 [M-H- C5H8O5N]-、42.00 [M-H-C7H10N2O4]-的碎片離子，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C9H12N2O6，經(jīng)對照品比對，推測該化合物為尿苷，二級質(zhì)譜及可能的裂解方式見圖5。

圖5 尿苷的二級質(zhì)譜圖（a），對照品的二級質(zhì)譜圖（b）及其裂解規(guī)律（c） Fig.5 Secondary mass spectrogram of uridine (a), secondary mass spectrogram of reference (b), mass spectrometric fragmentation pattern of uridine (c)

2.1.4 其他類化合物的鑒定

結(jié)合數(shù)據(jù)庫與相關(guān)文獻及二級碎片離子信息，本研究從爬沙蟲不同部位中推測可能還含有左旋肉堿、維生素b2、D-山梨醇、樟腦、胡薄荷酮。

2.2 多元統(tǒng)計分析

以2.1所鑒定的化合物的峰面積為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件中進行主成分分析，結(jié)果見圖6。由圖可見，爬沙蟲不同部位可以較好的分離，說明爬沙蟲頭、胸、腹三個部位彼此之間的化學(xué)內(nèi)涵存在較大差異。在PCA分析的基礎(chǔ)上，利用OPLS-DA模型將爬沙蟲不同部位樣品進行兩兩比較，得到散點圖，見圖7（a、b、c）；之后建立S-plot，以找出不同部位樣品間差異化合物，見圖7（d、e、f）。S-plot圖中數(shù)據(jù)點離原點越遠對樣品分組差異的貢獻值越大，結(jié)合變量權(quán)重重要性排序（VIP）進行篩選，條件為VIP＞1，從爬沙蟲不同部位中共篩選到纈氨酸，次黃嘌呤，煙酸，苯丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸6個差異最大的化合物。

圖6 爬沙蟲不同部位的PCA圖 Fig.6 PCA score plot of different parts of hellgrammites

圖7 爬沙蟲不同部位的OPLS-DA圖和S-plot圖 Fig.7 OPLS-DA score plot and S-plot of different parts of hellgrammites

2.3 爬沙蟲不同部位差異化合物含量的測定

取1.2.2.1項下供試品溶液，按1.2.2.3項下色譜條件進行測定，將峰面積代入回歸方程，分別計算煙酸、次黃嘌呤、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量，結(jié)果見表2。采用SPSS 26.0進行顯著性差異分析，p＜0.05認為6種成分在頭、胸、腹三個部位之間均具有顯著性差異。

圖8 混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖 Fig.8 HPLC chromatograms of mixed reference standard solution and sample

表2 爬沙蟲不同部位差異化學(xué)成分含量測定（mg/g，n=3） Table 2 Content of 6 different chemicals in different parts of hellgrammites (mg/g, n=3)

2.4 分析與討論

2.4.1 爬沙蟲化學(xué)成分分布規(guī)律與物質(zhì)基礎(chǔ)分析

爬沙蟲不同部位推斷出25種成分，包括氨基酸類成分9種，有機酸類成分6種，核苷類成分5種，其他類成分5種。文獻分析表明其中19個成分，包括3個氨基酸（脯氨酸、谷氨酸、色氨酸）、6個有機酸、5個核苷及5個其它化合物為爬沙蟲中首次報道。由表1可知，在其頭、胸、腹中分別鑒定出19、21、19種化合物，不同部位共有化合物14種（包括7種氨基酸類成分，2種有機酸類成分，2種核苷類成分，3種其它化合物）。爬沙蟲不同部位共有成分較多，整體成分相似，多元統(tǒng)計分析結(jié)果表明爬沙蟲不同部位成分含量差異較大，正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）篩選出6種差異最大化合物，經(jīng)HPLC測定含量驗證，表明6種成分在頭、胸、腹三個部位之間均具有顯著性差異。

爬沙蟲化學(xué)成分具有多種藥理作用，根據(jù)文獻報道，爬沙蟲中所檢測的苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酸4種氨基酸在維持人體氮平衡中發(fā)揮重要作用[13]，是重要的功能性成分。有機酸類成分如肉桂酸有減小心肌缺血再灌注損傷、抗腫瘤等作用[14]，異貝殼杉烯酸具有抗菌、抗炎等活性[15]。核苷類成分亦有抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用[16,17]。上述成分的發(fā)現(xiàn)可為爬沙蟲藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。此外，在爬沙蟲頭、胸、腹中均檢測到左旋肉堿，在三個部位中相對峰面積均較大且無顯著差異，該成分對腎臟[18,19]和腎小管上皮細胞[20,21]具有顯著保護作用，可能是爬沙蟲入藥發(fā)揮腎臟保護作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

2.4.2 爬沙蟲差異化學(xué)成分與使用部位分析

本文結(jié)果表明煙酸、次黃嘌呤、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸為爬沙蟲頭、胸、腹三個部位之間的主要差異化學(xué)成分。含量測定結(jié)果顯示，煙酸、次黃嘌呤在頭、胸、腹中的含量極低，而纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在頭、胸、腹中的含量較高，且頭、胸含量顯著高于腹部。

爬沙蟲在食用時，部分地區(qū)會去掉頭、胸，推測可能主要考慮到頭、胸具有硬殼與嘴夾，食用不便，口感不佳等因素有關(guān)。而爬沙蟲入藥時則與食用時不同，《黔南本草》中記載，爬沙蟲入藥時常以干燥全蟲入湯劑，或研末入丸、散劑[22]，不必考慮其食用是否方便，口感等問題。且爬沙蟲中纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在頭、胸中的含量顯著高于腹部，這4種必需氨基酸常參與人體的免疫調(diào)節(jié)，這可能是爬沙蟲作為全蟲入藥的又一原因之一。

作為藥食兩用型資源，爬沙蟲在不同用途時（食用、藥用）可根據(jù)使用目的采用不同的部位（腹、全蟲）。爬沙蟲在作為食材時，將頭、胸作為廢棄物，可將其收集起來作為藥用原材料，進一步節(jié)約資源。囿于系統(tǒng)化學(xué)方法的局限性，目前本文只對鑒定出的25種成分進行分析，爬沙蟲中還含有大量其他成分，特別是氨基酸類，課題組在前期測定其富含纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等7種人體必需氨基酸[3]。因此本文后續(xù)展開對爬沙蟲不同部位每類化合物的深入研究與分析，結(jié)合營養(yǎng)功能與藥用功能，進一步確證爬沙蟲使用部位選擇的科學(xué)性，為其加工以及資源更合理的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

3 結(jié)論

本文運用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對川滇特產(chǎn)爬沙蟲不同部位的化學(xué)成分以及成分差異物質(zhì)進行含量分析，在爬沙蟲頭、胸、腹中共鑒定出25種化合物，6種主要差異物，除纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、組氨酸6種[3]成分外，其他19種化合物均為爬沙蟲中首次報道。該方法快速，簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，為藥食兩用的動物源食材爬沙蟲的研究提供技術(shù)支撐，同時本實驗為爬沙蟲進一步藥用物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)，有利于其使用部位的選擇與產(chǎn)地加工、資源的合理利用開發(fā)。