蘭 豐，王新語(yǔ)，姚 杰，姜 蔚,*，徐靜靜，孫 林，王志新,*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（煙臺(tái)），山東 煙臺(tái) 265500；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

近幾年，中國(guó)每年食用植物油消費(fèi)量都在3 000萬(wàn) t以上，已成為全球最大的食用植物油消費(fèi)國(guó)。食用植物油是人體必需脂肪酸的主要來(lái)源之一，其質(zhì)量和安全直接關(guān)系到人體的健康。

鏈格孢屬真菌能夠產(chǎn)生70余種代謝產(chǎn)物，其中一些有致癌、致畸毒性，典型代表有細(xì)交鏈格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）、交鏈格孢酚甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、交鏈孢烯（altenuene，ALT）和騰毒素（tentoxin，TEN），化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。鏈格孢屬真菌能夠侵染大豆、油菜、向日葵等，導(dǎo)致油料作物減產(chǎn)，還能產(chǎn)生真菌毒素，繼而污染后續(xù)加工的食用油。加強(qiáng)食用植物油中鏈格孢霉毒素的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)尤為必要。中國(guó)目前尚未制定鏈格孢霉毒素在食品中的最大允許殘留限量，但歐盟自2011年就已開(kāi)展鏈格孢酚霉毒素對(duì)不同人群的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，為制定最大殘留限量做準(zhǔn)備。

圖1 典型鏈格孢霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of typical Alternaria toxins

TeA具有互變異構(gòu)和旋轉(zhuǎn)異構(gòu)特性，色譜分離比較困難，以前的研究大都排除TeA，僅測(cè)定另外幾種毒素，還有的采用柱前衍生法只測(cè)定TeA。雖然柱前衍生法改變了TeA的性質(zhì)、改善了色譜行為，但在實(shí)際操作過(guò)程中，衍生重現(xiàn)性并不令人滿意。鏈格孢霉毒素的檢測(cè)在果蔬及其制品方面應(yīng)用較多，而植物油方面鮮有報(bào)道。2020年有研究者使用質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定葵花籽油中5 種鏈格孢霉毒素，運(yùn)用同位素內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)效應(yīng)。目前已有的植物油中鏈格孢霉毒素的檢測(cè)方法主要使用80%甲醇溶液提取，后續(xù)的氮吹濃縮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分毒素有損失。此外，由于部分鏈格孢霉毒素還缺乏相應(yīng)的同位素標(biāo)準(zhǔn)品，而且費(fèi)用昂貴，該方法還不能被普遍應(yīng)用。

針對(duì)上述存在的問(wèn)題，本研究擬從前處理入手，利用正交試驗(yàn)獲得較佳的植物油前處理方法，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，以期建立便于操作和應(yīng)用的植物油中鏈格孢霉毒素檢測(cè)方法，為制定我國(guó)食品中鏈格孢霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TeA、AOH、AME、ALT和TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfor公司；乙腈、甲醇（均為質(zhì)譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；碳酸銨（優(yōu)級(jí)純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-MS 8040液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 日本島津公司；BEH C色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美國(guó)Waters公司；SK-1渦旋混勻器 常州國(guó)華電器有限公司；BS323S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；TD5AWS離心機(jī) 上海盧湘儀儀器有限公司；N-EVAP氮吹儀美國(guó)Organomation公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 德國(guó)默克公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取一定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解，配制成一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別量取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋、定容，配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液由陰性樣品的提取液經(jīng)氮吹近干后用標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶后獲得。

1 mmol/L碳酸銨溶液：稱(chēng)取0.157 g碳酸銨固體溶解于1 000 mL水中。

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取2.0 g食用油于10 mL塑料離心管中，加入4 mL甲醇-乙腈（1∶1，/）溶液，渦旋10 s，于5 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液于10 mL塑料離心管中，70 ℃氮吹至近干，加入0.5 mL甲醇復(fù)溶后，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過(guò)濾到裝有塑料內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，上機(jī)待測(cè)。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

流動(dòng)相：A為乙腈，B為1 mmol/L碳酸銨溶液；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL；柱溫30 ℃；梯度洗脫條件：0.0～1.0 min，10% A、90% B；1.0～4.0 min，10%～95% A、90%～5% B；4.0～7.0 min，95% A、5% B；7.1 min，10% A、90% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子電離模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描；加熱模塊溫度400 ℃；脫溶劑管溫度250 ℃；霧化氣（氮?dú)猓┝魉?.0 L/min；干燥氣（氮?dú)猓┝魉?5 L/min；碰撞氣（氬氣）壓力230 kPa。5 種鏈格孢霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5 種鏈格孢霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 5 kinds of Alternaria toxins

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Labsolutions軟件（Shimadzu公司）進(jìn)行超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，ChemDraw Ultro 8.0軟件進(jìn)行鏈格孢霉毒素結(jié)構(gòu)式的繪制，OriginPro 8.5軟件進(jìn)行鏈格孢霉毒素總離子流圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

p值是影響化合物色譜行為的因素之一。AOH、ALT、AME的p值分別為7.6、7.5、7.7，呈弱酸性，TEN呈中性。這4 種毒素在C柱上都能較好地保留。TeA的p值為4.3，酸性比其他4 種毒素強(qiáng)，極性更大。首先測(cè)試Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Waters Fluoro-Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩款適合分析極性化合物的色譜柱，發(fā)現(xiàn)使用這兩款分離柱未能獲得TeA目標(biāo)峰。在同樣條件下測(cè)試了其他幾種色譜柱，包括Agilent Eclipse XDB C（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、Agilent ZORBAX SB C（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、Waters BEH C（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters Phenyl-Hexyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、SHIMADZU Shim-pack XR-ODS（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）、GL Sciences Bio C（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）等，發(fā)現(xiàn)TeA僅在XDB C上出峰。這可能與這款色譜柱采用了封端的技術(shù)，覆蓋了硅醇基，減弱了TeA與硅醇基之間的相互作用。但封端并沒(méi)有完全覆蓋硅醇基，導(dǎo)致TeA峰寬過(guò)大、拖尾，峰形不平滑尖銳，在嘗試各種流動(dòng)相條件后仍不能改善。

草甘膦的極性強(qiáng)而且具有螯合性，性質(zhì)與TeA相似。前期實(shí)驗(yàn)室在堿性流動(dòng)相條件下，獲得較好的草甘膦色譜峰，受其啟發(fā)，嘗試在流動(dòng)相中加入碳酸銨，使用耐堿性的BEH C色譜柱分離5 種毒素，獲得較好的TeA色譜峰，其他4 種毒素峰形和靈敏度都得到了改善和提高。以甲醇作有機(jī)流動(dòng)相時(shí)，在291/229（ALT定量離子對(duì)）通道中ALT的出峰時(shí)間前后基線較高，可能會(huì)影響ALT的定量。嘗試變化流動(dòng)相梯度洗脫程序，基線異常的情況沒(méi)有改變。以乙腈作流動(dòng)相時(shí)，基線恢復(fù)正常，因此把碳酸銨溶液和乙腈作為流動(dòng)相。考察碳酸銨在1、2 mmol/L和3 mmol/L質(zhì)量濃度條件下毒素響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)隨著碳酸銨濃度的增加，5 種毒素的靈敏度均有部分降低。因此，確定碳酸銨使用濃度為1 mmol/L。最終確定以乙腈和1 mmol/L碳酸銨溶液為流動(dòng)相，以BEH C柱為分離柱進(jìn)行5 種毒素的分析。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

5 種毒素分別用甲醇配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射方式，在/100～1 000范圍內(nèi)進(jìn)行正負(fù)全掃描。5 種毒素均能找到相應(yīng)的加氫和減氫母離子。一般情況下加氫離子的靈敏度高于減氫離子，通常會(huì)選擇靈敏度更高的加氫離子作母離子進(jìn)行后續(xù)的條件優(yōu)化?？紤]到流動(dòng)性為堿性，更有利于氫的失去，因此選擇5 種毒素的減氫離子作為母離子。對(duì)確定的母離子進(jìn)行打碎，分別找到響應(yīng)高的2 個(gè)產(chǎn)物離子作為子離子。在確定的母離子和子離子的基礎(chǔ)上，優(yōu)化Q1、Q3電壓和碰撞電壓等參數(shù)，獲得5 種毒素的質(zhì)譜參數(shù)（表1），典型色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 定量限質(zhì)量濃度下的鏈格孢霉毒素總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of Alternaria toxins at LOQ

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取條件的優(yōu)化

影響提取效率的因素有很多，其中包括溶劑對(duì)目標(biāo)物的溶解性、溶劑對(duì)基質(zhì)的浸透和擴(kuò)散能力以及提取時(shí)間等。正交試驗(yàn)?zāi)軓亩鄠€(gè)因素中快速找到影響結(jié)果的關(guān)鍵因素和最優(yōu)方案。因此，本研究選取提取溶劑、提取劑體積和提取時(shí)間3 個(gè)影響提取效率的主要因素設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，以回收率為指標(biāo)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=3）Table 2 Orthogonal array design and experimental results (n = 3)

從表2可以看出，對(duì)于TeA，提取溶劑的類(lèi)型對(duì)結(jié)果影響最大，提取劑體積和時(shí)間影響較小。極性較強(qiáng)的甲醇有利于TeA的提取，而純乙腈提取效率最差，這可能與TeA的極性較強(qiáng)有關(guān)。提取溶劑類(lèi)型對(duì)結(jié)果影響較大的還有AME，但對(duì)于AME，乙腈是較好的提取溶劑，這可能與AME具有親酯性，極性較小有關(guān)。提取劑體積對(duì)AME的影響次之，從結(jié)果看4 mL的提取體積更有利于AME的提取，影響最小的是提取時(shí)間。另外3 種毒素ALT、AOH和TEN的情況一致，提取劑體積對(duì)回收率影響最大，溶劑類(lèi)型影響次之，提取時(shí)間影響最小，從結(jié)果看，4 mL體積對(duì)這3 種毒素提取效果最好。從整體看，TeA和AME對(duì)溶劑類(lèi)型要求較高，甲醇和乙腈混合提取兼顧了二者的極性，提取效果最好，ALT、AOH、TEN和AME在4 mL體積時(shí)提取效果最佳，TeA在3 種體積下，提取效率相差不大，因此確定5 種毒素的提取體積為4 mL，而提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)物的回收率結(jié)果影響最小，考慮效率因素，確定提取時(shí)間為10 s。

2.2.2 其他條件的確定

前處理中使用玻璃離心管會(huì)降低AOH、AME和TeA的回收率，因此渦旋提取過(guò)程應(yīng)使用塑料離心管。玻璃進(jìn)樣瓶對(duì)TeA的吸附較明顯，長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)樣，TeA的響應(yīng)值會(huì)有降低，應(yīng)使用塑料或帶有塑料內(nèi)襯管進(jìn)樣瓶。尼龍濾膜對(duì)AME和AOH有吸附，而聚四氟乙烯膜對(duì)這5 種毒素均沒(méi)有吸附，應(yīng)使用聚四氟乙烯有機(jī)系膜。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)和線性范圍

基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)主要是比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，計(jì)算公式為：基質(zhì)效應(yīng)/%=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率－1）×100。葵花籽油、大豆油陰性樣品經(jīng)提取、氮吹后，用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶得到5 種毒素系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用甲醇配制。表3顯示，AOH、ALT、TEN和AME的質(zhì)量濃度范圍為0.002～0.2 mg/L，TeA質(zhì)量濃度范圍為0.02～0.2 mg/L。5 種毒素在配制的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，≥0.998。代表性的兩種基質(zhì)中5 種毒素的基質(zhì)效應(yīng)在2.9%～18.7%之間，均小于20%，說(shuō)明在該前處理和儀器條件下，5 種毒素在植物油基質(zhì)中存在弱的基質(zhì)效應(yīng)，可以忽略。在定量時(shí)可以直接使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表3 典型鏈格孢霉毒素的線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear ranges and matrix effect of typical Alternaria toxins

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

以陰性的葵花籽油和大豆油為代表性基質(zhì)，添加3 個(gè)水平的毒素，渦旋靜置1 h后，按1.3.2節(jié)前處理和1.3.3節(jié)實(shí)驗(yàn)條件檢測(cè)，結(jié)果如表4所示，TeA在0.02、0.1 mg/kg和0.2 mg/kg添加量下，其余4 種毒素在0.002、0.02 mg/kg和0.2 mg/kg添加量下，5 種毒素的平均回收率在98%～118%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%～17.4%之間，滿足分析要求。而TeA在低于0.02 mg/kg添加量下，另外4 種毒素在低于0.002 mg/kg添加量下，其回收率和精密度不能滿足檢測(cè)要求。因此，根據(jù)添加回收實(shí)驗(yàn)，確定TeA的定量限為0.02 mg/kg，其余4 種毒素的定量限為0.002 mg/kg。

表4 典型鏈格孢霉毒素在2 種代表性植物油基質(zhì)中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 4 Recoveries and RSDs of typical Alternaria toxins in two representative vegetable oils (n = 5)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)超市購(gòu)買(mǎi)的芝麻油、大豆油、葵花籽油、花生油等10 個(gè)植物油樣品進(jìn)行鏈格孢霉毒素檢測(cè)，在芝麻油和葵花籽油中均檢出AME，質(zhì)量濃度分別為0.005～0.02 mg/L和0.003～0.008 mg/L，其他4 種毒素未檢出，見(jiàn)表5。水媒法是芝麻油和葵花籽油生產(chǎn)的常見(jiàn)方法，AME具有親酯性，在植物油生產(chǎn)過(guò)程中可能更多地保留在油脂層，而其他4 種毒素的極性較AME更強(qiáng)，更多可能進(jìn)入了水層，這可能是AME檢出率高的原因。

表5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of determination of Alternaria toxins in actual samples

3 結(jié) 論

建立了食用植物油中5 種鏈格孢霉毒素簡(jiǎn)便、高效測(cè)定方法。利用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取溶劑、提取劑體積和提取時(shí)間等前處理要素條件。采用碳酸銨溶液和乙腈為流動(dòng)相優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，所建方法基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以通過(guò)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線直接定量，實(shí)現(xiàn)了植物油中鏈格孢霉毒素的高效檢測(cè)。通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AME在植物油樣品中檢出率較高，其他4 種毒素未檢出，分析可能與植物油的生產(chǎn)工藝有關(guān)，這對(duì)以后優(yōu)化和改進(jìn)相關(guān)生產(chǎn)工藝有一定幫助。但方法中TeA的響應(yīng)相對(duì)其他4 種毒素要低，需要進(jìn)一步研究和改進(jìn)。