姚小龍，韓 磊，劉旭東，羅 躍，吳 瓊，安華明，吳小毛,*

（1.貴州大學作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省植保植檢站，貴州 貴陽 550001；3.貴州省果樹工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025）

刺梨（Tratt.）學名繅絲花，屬薔薇科薔薇屬植物，又名山王果、刺莓果、佛朗果、茨梨、木梨子，別名刺菠蘿、送春歸、刺酸梨子、刺梨薔薇、九頭鳥、文先果、刺石榴（陜西），是一種稀有的、滋補健身的營養(yǎng)珍果。刺梨主要以貴州、四川、云南、湖北、湖南分布面積大，產量多，其中貴州省的野生刺梨分布最多，也是該省特有的優(yōu)勢資源。刺梨果實富含多種維生素、氨基酸和微量元素以及胡蘿卜素、有機酸、黃酮、-谷甾醇、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，其中，每100 g刺梨果肉中，含VC 2 054～2 725 mg、VP 5 980～12 895 mg、SOD活力32 100 U，遠超過獼猴桃、柑橘、樹莓等水果，是當之無愧的“VC之王”和“三王之果”，也是目前世界上第三代水果之冠。

近年來，隨著刺梨栽培面積的不斷擴大，各種病害如刺梨白粉病、褐斑病、煙煤病、莖腐病、病毒病等，蟲害如梨小食心蟲、小實蠅、蚜蟲、粉虱、介殼蟲等，雜草如馬塘、酢漿草、牛筋草、狗尾草、馬齒莧等病蟲草害問題逐漸凸顯。雖然中國農藥信息網并未登記有農藥可在刺梨生產上使用，但通過對貴州刺梨主產區(qū)進行調研發(fā)現，果農為了保產，常使用苯醚甲環(huán)唑、吡蟲啉、吡唑醚菌酯、敵草隆、啶蟲脒、多菌靈、腈菌唑、氯蟲苯甲酰胺、醚菌酯、嘧菌酯、三唑酮等殺蟲劑、殺菌劑以及除草劑以達到快速防治病蟲草的目的。在即將實施的GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》標準中也未規(guī)定有關刺梨的農藥最大殘留限量，所以上述農藥在刺梨生產上長期施用，是否會有殘留，殘留量多少以及對刺梨的質量安全會不會造成影響，都有待研究。因此，有必要開展刺梨上常用農藥快速分析方法的研究，為刺梨上農藥的使用、監(jiān)管提供技術支撐。

目前，水果中常用的農藥檢測方法有氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法。常用的樣品前處理技術有QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法、固相微萃取法、微波萃取法等，其中QuEChERS法從誕生之初就被用作果蔬中農藥殘留的前處理方法，由于其快速簡便的特點，逐漸被推廣至更大的檢測范圍和基質中，成為了農藥殘留快速前處理技術的首選。如今QuEChERS法已廣泛應用于色譜-串聯質譜分析果蔬中農藥殘留的研究。目前已有文獻報道氣相色譜-串聯質譜法分析刺梨中多種有機氯農藥殘留的研究，但根據實際調研結果看，有機氯類農藥在刺梨生產上并不常用，而且氣相色譜不易分析一些極性強、熱穩(wěn)定性差的農藥，所以急需建立一種可靠性高、穩(wěn)定性好、檢測范圍廣的液相色譜-串聯質譜法。同時由于刺梨樣品基質復雜，含有較多的維生素、SOD、有機酸以及刺梨苷和黃酮類活性物質，會對農藥的提取產生干擾，提取率低，并會產生較強的基質干擾而對檢測結果的準確性產生影響，導致刺梨中農藥殘留的提取和凈化更復雜，所以常規(guī)的QuEChERS方法已不能滿足刺梨中農藥殘留檢測的需求。本研究擬在充分調研刺梨生產上常用典型農藥的基礎上，通過優(yōu)化QuEChERS前處理方法和測定條件，結合超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）檢測，建立一種同時快速檢測刺梨中11 種常用農藥的多殘留分析方法，能滿足刺梨農藥多殘留分析檢測需求，為刺梨生產上常用典型農藥的檢測、刺梨農藥合理使用以及安全性監(jiān)測工作提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試11 種農藥標準品：苯醚甲環(huán)唑（純度＞98%）、吡蟲啉（純度＞98%）、敵草隆（純度＞99%）、啶蟲脒（純度＞99%）、多菌靈（純度＞99%）、腈菌唑（純度＞98%）、嘧菌酯（純度＞99%）、三唑酮（純度＞99%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；吡唑醚菌酯（純度＞99%）、醚菌酯（純度＞97%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；氯蟲苯甲酰胺（純度＞95%） 上海畢得醫(yī)藥科技有限公司。

C（40～60 μm）、-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～60 μm） 天津博納艾杰爾科技有限公司；弗羅里硅土（Florisil）（100～200 目） 國藥集團化學試劑有限公司；石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB） 上海阿拉丁生化科技有限公司；無水硫酸鎂（分析純） 天津市永大化學試劑有限公司；氯化鈉、甲醇、甲酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、冰醋酸（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；氨水（分析純） 重慶川東化工有限公司；乙腈（分析純） 上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國默克公司；甲酸（色譜純）上海麥克林生化科技有限公司；純凈水 娃哈哈集團有限公司；0.22 μm濾頭 廣州彼西絡有限公司；1 mL注射器 江西益康醫(yī)療器械集團有限公司；2 mL樣品瓶美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

UPLC-MS/MS儀（包括1290 Infinity II超高效液相色譜儀和6470三重四極桿質譜儀） 美國Agilent公司；MS200多管渦旋混勻儀 杭州瑞誠儀器有限公司；1-16小型高速離心機 德國Sigma公司；CK2000高通量組織研磨儀 北京托摩根生物科技有限公司；BY-400B型離心機 北京白洋醫(yī)療器械有限公司；AL104分析天平上海梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取10.0 g經粉碎后的刺梨樣品置于50 mL離心管，加入15 mL經篩選的提取劑（乙腈）溶液振蕩提取10 min，然后依次加入1.0 g氯化鈉、4.0 g無水硫酸鎂，振蕩5 min，再4 000 r/min離心5 min。取1.5 mL上清液至裝有150 mg無水硫酸鎂＋經篩選凈化劑（50 mg PSA＋5 mg GCB）的2 mL離心管中，2 000 r/min渦旋3 min，12 000 r/min離心5 min，用1 mL注射器抽取上清液過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS檢測。

1.3.2 標準溶液的配制

11 種農藥標準品母液（100 μg/mL）：分別準確稱量（精確到0.001 g）11 種農藥標準品，用乙腈溶解，分別配制成100 μg/mL的標準母液，于4 ℃冰箱冷藏保存。

標準混合溶液（1 μg/mL）：準確移取11 種農藥標準母液各0.1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，于4 ℃冰箱冷藏保存。

溶劑標準工作曲線：分別向1 mL容量瓶中加入1、5、10、20、40 μL 1 μg/mL的混合標準儲備液，用乙腈定容至刻度，配制成0.001、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL的溶劑標準混合工作溶液，現配現用。

基質標準工作曲線：分別向1 mL容量瓶中加入1、5、10、20、40 μL 1 μg/mL的混合標準儲備液，用空白樣品提取液定容至刻度，配制成0.001、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL的溶劑標準混合工作溶液，現配現用。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，洗脫程序見表1；運行時間：5 min。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for UPLC

1.3.3.2 質譜條件

離子源：帶有安捷倫噴射流技術的電噴霧電離源；離子掃描模式：正離子掃描模式；掃描方式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；鞘氣溫度和流速：250 ℃和11.0 L/min；噴嘴電壓：500 V；毛細管電壓：4 000 V；霧化氣壓力：45 psi；干燥氣溫度和流速：300 ℃和5 L/min；干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣均為高純氮氣。

1.3.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

1.3.4.1 提取

稱取10.0 g勻漿空白刺梨樣品置于50 mL離心管（每個處理3 個平行），添加標準物靜置30 min后，加入15 mL提取劑溶液振蕩提取10 min，然后加入1.0 g氯化鈉，4.0 g無水硫酸鎂，振蕩5 min，然后4 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm檢測，通過計算11 種農藥的回收率考察提取效果。接著再以0.1%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、0.1%冰醋酸-乙腈、1%冰醋酸-乙腈、1%氨水-乙腈作為提取劑，考察常用緩沖劑對農藥提取率的影響，實驗步驟同上。

1.3.4.2 凈化

在優(yōu)化的提取條件下，提取完成之后離心，取1.5 mL上清液至裝有150 mg無水硫酸鎂和不同凈化材料的2 mL離心管中，先2 000 r/min渦旋3 min，再12 000 r/min離心5 min，用1 mL注射器抽取上清液過0.22 μm濾膜檢測，通過計算11 種農藥的回收率考察不同凈化材料對農藥的吸附情況。

1.4 數據分析與圖表繪制

所有數據均在Agilent公司的MassHunter Data Acquisition 10.0軟件下采集，采用MassHunter Quantitative Analysis 10.0軟件進行定量分析，采用Qualitative Analysis 10.0軟件進行定性分析，采用Python編程語言配合Matplotlib第三方庫進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能量、駐留時間、加速電壓等儀器條件設置，篩選能產生高響應、特異離子對的質譜條件，采用正離子掃描和MRM模式的方式一針進樣完成對所有目標物的檢測，結果見表2，優(yōu)化后11 種農藥的MRM定量離子色譜圖如圖1所示。

表2 11 種農藥的質譜參數Table 2 Mass spectrometric parameters of 11 pesticides

圖1 11 種農藥定量離子色譜圖Fig. 1 Chromatograms of quantitative ion pairs of 11 pesticides

2.2 樣品前處理優(yōu)化結果

2.2.1 提取

表3 不同提取方法的11 種農藥總體回收率Table 3 Total recoveries of 11 pesticides with different extraction methods

考察乙腈、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷4 種提取劑的提取效率，結果顯示乙腈的提取效率較其他提取劑好，平均回收率能達到99%（表3）。從表3可以看出，添加緩沖劑后，11 種農藥的平均回收率在63%～74%之間，說明在提取劑中加入一些緩沖劑如甲酸、冰醋酸和氨水等并不能提高乙腈的提取率，因此最終確定提取劑為乙腈。

2.2.2 凈化

表4 不同凈化劑凈化后的11 種農藥總體回收率Table 4 Total recoveries of 11 pesticides with different sorbents

QuEChERS方法常用凈化材料有C、PSA、Florisil和GCB。C可用來除脂，PSA可用來消除各種果蔬的有機酸、色素及一些糖和脂肪酸，GCB可用來去除甾體、葉綠素等色素，但對含苯官能團的化合物有較強吸附作用，降低其回收率。因此，本研究考察C、PSA、Florisil和GCB四種凈化材料單獨使用與組合使用對待測物回收率的影響。除PSA外，其他凈化劑均對少數農藥有一定的吸附，尤其是含GCB的凈化劑影響最大，導致個別農藥回收率偏低（表4）。從表4還可看出，通過將回收率最高的PSA與不同質量的GCB混合使用后發(fā)現，隨著GCB的質量減少，回收率不斷上升，當GCB質量為5 mg時回收率最為理想，達到了86%，同時上清液比只添加PSA的上清液更加澄清。盡管50 mg PSA與5 mg GCB復合凈化的回收率（86%）不如PSA單獨凈化高（97%），但沒有添加GCB凈化劑的樣品含有較多色素，加大了色譜柱和檢測器被污染的風險，綜合考量，本實驗最終選擇50 mg PSA＋5 mg GCB作為凈化劑。

2.3 方法評價

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限及基質效應

基于已優(yōu)化的分析條件，用空白刺梨樣品的提取液將1.3.2節(jié)標準混合溶液稀釋成質量濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL的基質標準混合溶液，經UPLC-MS/MS測定后，以每種農藥定量離子峰面積為縱坐標，農藥基質標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示，11 種農藥在0.001～0.04 μg/mL范圍內呈現出良好的線性關系，相關系數（）均大于0.99，以信噪比=3估算檢出限（limits of detection，LOD），以=10確定定量限（limits of quantitation，LOQ），11 種農藥LOD為1.31～8.56 μg/kg，LOQ為4.13～43.57 μg/kg，結果見表5。

表5 11 種農藥的線性方程、相關系數、離子抑制率、LOD及LOQTable 5 Linear equations, correlation coefficients, ion suppression percentages, LODs and LOQs of 11 pesticides

基質效應是使用LC-MS/MS檢測殘留應盡量避免。參照文獻[41-44]報道，離子抑制率計算公式為：

式中：為基質匹配標準曲線的斜率；為純溶劑標準曲線的斜率。

當離子抑制率為0時，表示無基質效應；當離子抑制率大于0時，表示樣品基質對目標化合物的測定存在基質增強作用；當離子抑制率小于0時，表示樣品基質對目標化合物的測定存在基質抑制作用。通過比較11 種農藥在刺梨基質中的離子抑制率，實驗結果發(fā)現：刺梨樣品基質對除吡蟲啉外的所有農藥均是較為顯著的基質抑制效應（表5），離子抑制率的絕對值均大于0.1，因此為消除基質效應帶來的影響，需采取基質標準曲線進行校正。

2.3.2 方法準確度與精密度結果

在刺梨樣品中添加11 種目標農藥的混合標準溶液，添加量均分別100、1 000、5 000 μg/kg。由表6可知，11 種農藥的平均添加回收率在84.5%～103.8%之間，相對標準偏差（=6）在1.2%～8.5%之間，方法具有較好的回收率和重復性，滿足農藥殘留分析的要求。

表6 11 種農藥在刺梨中的添加回收率和相對標準偏差Table 6 Recoveries and RSDs of 11 pesticides in spiked R. roxburghii

3 結 論

建立了同時檢測刺梨中11 種常用農藥殘留的UPLC-MS/MS方法。該方法靈敏度高、重復性好，經過系列方法學驗證，11 種常用農藥的方法LOD在1.31～8.56 μg/kg之間，LOQ在4.13～43.57 μg/kg之間，線性相關系數（）在0.991 2～0.999 9之間；平均添加回收率在84.5%～103.8%之間，相對標準偏差（=6）在1.2%～8.5%之間。該方法準確、快速、操作簡單、凈化效果好，對于推進政府監(jiān)管部門執(zhí)法、提高檢測效率、降低檢測成本、推進第三方檢測市場整體技術進步等具有重要的實踐意義和社會效益，可應用于刺梨農藥使用和安全性監(jiān)測工作中。