葛嘉雨梁海燕劉冬李春靈張豐泉趙茜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

在研究水中有機(jī)污染檢測(cè)方法中,固相萃取(solid phase extraction,SPE)具有操作簡(jiǎn)單、效率高、安全性高、成本低以及適于大體積水樣前處理等優(yōu)點(diǎn)[10];氣相色譜-質(zhì)譜儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC/MS)既可以利用氣相色譜強(qiáng)大的分離能力,又具有質(zhì)譜在鑒定未知物方面較高的靈敏度,能夠較好地解決水環(huán)境介質(zhì)復(fù)雜的問題,也非常適于BPs這類熱穩(wěn)定性好、易揮發(fā)物質(zhì)的定性與定量分析[11].此外,對(duì)于BPs的自身特性問題,衍生化反應(yīng)[12]可以有效地改善BPs極性,進(jìn)而優(yōu)化其色譜和質(zhì)譜響應(yīng),提高其分離度和檢測(cè)方法的靈敏度.因此,擬采用乙酸酐為衍生化試劑,將酰基基團(tuán)引入BPs分子中,衍生后的BPs經(jīng)SPE富集純化,以GC/MS為檢測(cè)儀器的分析方法,通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)分析方法,并以市政供水為測(cè)試水樣驗(yàn)證方法的實(shí)用性,建立水相中BPs柱前衍生-SPE-GC/MS檢測(cè)方法,為今后其分析方法的優(yōu)化提供參考,并為研究環(huán)境、生命、地球、材料等科學(xué)領(lǐng)域BPs的控制、削減以及潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等問題提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent7890A-5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備HP-5MS毛細(xì)管柱,30 m×0.25 mm×0.25μm)和Agilent7890A 氣相色譜儀配備電子捕獲檢測(cè)器(ECD)和30 m×0.32 mm×0.25μm HP-5毛細(xì)管柱;Supelco 12位固相萃取裝置;C18固相萃取小柱(6 m L,500 mg);PEP固相萃取小柱(3 m L,60 mg);HLB固相萃取小柱(3 m L,60 mg).5種BPs標(biāo)準(zhǔn)品:2-溴酚(2-BP)、2,4-二溴酚(2,4-DBP)、2,6-二溴酚(2,6-DBP)、3,5-二溴酚(3,5-DBP)、2,4,6-三溴酚(2,4,6-TBP)均購于北京百靈威科技有限公司;碳酸鉀(0.1 mol/L)、無水硫酸鈉和乙酸酐為分析純?cè)噭?天津市大茂化學(xué)試劑廠);甲醇、正己烷均為色譜純?cè)噭?美國(guó)J.T.Baker公司);高純水(18.2～18.3 MΩ·cm,上海和泰儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 BPs的衍生化反應(yīng)

向5種BPs標(biāo)準(zhǔn)品中依次加入碳酸鉀、乙酸酐,振搖5 min使其充分混勻進(jìn)行衍生化反應(yīng).以2-BP為例,衍生化反應(yīng)式如下所示:

衍生化反應(yīng)完成后,進(jìn)行固相萃取,收集萃取液并洗至中性,經(jīng)無水硫酸鈉脫水后上機(jī)待測(cè).通過對(duì)目標(biāo)物峰形、峰面積等色譜信號(hào)和行為的考察,進(jìn)行BPs衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化.

1.2.2 固相萃取[13]

固相萃取前安裝固相萃取裝置和抽真空裝置,SPE小柱采用甲醇和超純水各5 m L依次活化(每次加液需停留5 min),打開真空泵使液體流出.在柱內(nèi)液面與填料液面稍平時(shí),將100 m L 衍生后水樣以5 m L/min的速度通過小柱,富集完成后抽真空20 min去除小柱殘余水分,在柱頭加入2 m L正己烷并保留2 min,洗脫、收集后進(jìn)行儀器檢測(cè).結(jié)合目標(biāo)物的總離子流圖、回收率等檢測(cè)結(jié)果,對(duì)該操作步驟進(jìn)行優(yōu)化.

1.3 儀器條件

1.3.1 GC/MS參數(shù)[14]

色譜條件:進(jìn)樣口250℃;高純氦氣為載氣,流速1.50 m L/min;柱溫箱起始溫度40℃(保持1 min),以15℃/min升至225℃,再以40℃/min升至280℃(保持5 min);不分流進(jìn)樣模式,進(jìn)樣量1.0μL.質(zhì)譜條件:離子源溫度230℃,四級(jí)桿溫度150℃,接口溫度280℃,溶劑延遲5 min;全掃描模式掃描m/z=40～400;選擇離子掃描模式(SIM)下不同BPs的檢測(cè)離子如表1所示.

表1 BPs及其衍生產(chǎn)物的GC/MS檢測(cè)參數(shù)Tab.1 Scan parameters of BPs and BPs derivatives monitored by GC/MS

1.3.2 GC參數(shù)

進(jìn)樣口溫度250℃;檢測(cè)器溫度280℃;載氣為氮?dú)?流速1 m L/min);不分流進(jìn)樣模式,進(jìn)樣量1.0μL;升溫程序:起始溫度40℃(保持1 min),以15℃/min升至230℃,再以40℃/min升至280℃(保持5 min).

1.4 BP衍生產(chǎn)物工作曲線的繪制

稱取5種BPs標(biāo)準(zhǔn)品適量,用正己烷配制質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10μg/m L的混合標(biāo)樣,進(jìn)行衍生化反應(yīng)后繪制工作曲線。

1.5 質(zhì)量控制

分別取8份100.0 m L水樣,加入BPs標(biāo)準(zhǔn)品,其中4份樣品質(zhì)量濃度為4μg/m L,另4份為6μg/m L,經(jīng)1.2步驟處理后,進(jìn)行GC/MS分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)儀器的選擇

沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性較好的有機(jī)物適于采用GC、GC/MS 作為檢測(cè)儀器,因此分別采用2 種儀器對(duì)10μg/m L BPs標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),得到氣相色譜圖和總離子流圖(圖1).通過比較這2種儀器檢測(cè)后的譜圖、峰型等色譜行為,可以看出:相比于總離子流圖的檢測(cè)結(jié)果(圖1b),氣相色譜圖中2,4-DBP、2,6-DBP和2,4,6-TBP拖尾較嚴(yán)重,同時(shí)2-BP和3,5-DBP響應(yīng)值偏低(圖1a).因此,為了便于定量,選擇GC/MS作為水樣中BPs的檢測(cè)儀器.

圖1 5種BPs的氣相色譜和總離子流圖Fig.1 Gas chromatogram and total ion flow diagram of five BPs

2.2 衍生化實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

由于BPs分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,使其具有較高的親水性和極性,在GC/MS檢測(cè)時(shí)會(huì)影響自身的色譜信號(hào)和行為,如出現(xiàn)峰形不對(duì)稱、拖尾等現(xiàn)象,進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果.化學(xué)衍生化技術(shù)[12]可以通過衍生化試劑的引入,調(diào)整待測(cè)物的極性和提供特征離子,從而改善色譜響應(yīng)和質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度.目前,乙酸酐是酚類常用衍生試劑之一,相比于其他衍生化試劑(如丹酰氯[15]、五氟芐基溴[16]等),具有操作簡(jiǎn)單、成本低和毒性小等優(yōu)點(diǎn).但過量的乙酸酐會(huì)刺激人體眼睛和上呼吸道,并且腐蝕損傷儀器.因此需考察衍生前后、乙酸酐用量等實(shí)驗(yàn)條件,使BPs具有好的衍生化效率和色譜響應(yīng),便于更好的定性和定量.

2.2.1 衍生前后色譜行為比較

取2份含BPs標(biāo)準(zhǔn)品的高純水樣,其中1份加入乙酸酐進(jìn)行衍生化反應(yīng),之后2份樣品均采用SPE 和GC/MS檢測(cè),結(jié)果顯示:未衍生的BPs拖尾明顯(圖2a),而衍生后的5種BPs衍生產(chǎn)物(2-BP′,2,6-DBP′,2,4-DBP′,3,5-DBP′,2,4,6-TBP′)峰型對(duì)稱且不拖尾(圖2b), 表明采用乙酸酐衍生可以改善BPs色譜峰峰形、拖尾等問題,有利于其定性和定量分析.

圖2 衍生前后5種BPs的總離子流對(duì)比Fig.2 Total ion chromatograms of five BPs standards:without and with derivatization

2.2.2 乙酸酐的用量

乙酸酐作為衍生化試劑,其用量的變化不僅會(huì)影響衍生化效率、自身的酸性、腐蝕性以及黏度等性質(zhì)還可能會(huì)影響操作人員和儀器,因而需對(duì)其用量進(jìn)行探討.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示:隨乙酸酐用量增加,BPs衍生產(chǎn)物峰面積增加,當(dāng)其用量增至1.0 m L后,5種BPs衍生產(chǎn)物峰面積趨于穩(wěn)定.基于衍生化效率和避免乙酸酐殘留較多時(shí)對(duì)人員和儀器的影響,確定乙酸酐用量為1.0 m L.

表2 乙酸酐用量對(duì)BPs(4μg/m L)衍生產(chǎn)物峰面積的影響Tab.2 Effect of acetic anhydride on peak area of BPs(4μg/mL)derivatization products

2.3 SPE實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

在水相中痕量有機(jī)物的多種富集方法中,相比于液液萃取法,SPE 法具有簡(jiǎn)單快速、時(shí)間短、重復(fù)性好和成本低[10,17]等優(yōu)點(diǎn),且能夠處理較大采樣體積的水樣,適于BPs這類痕量有機(jī)污染物的準(zhǔn)確定量.因此,選用SPE法對(duì)BPs衍生產(chǎn)物進(jìn)行富集,并對(duì)其萃取實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,包括SPE小柱和洗脫時(shí)間等.

2.3.1 SPE小柱的選擇

通過文獻(xiàn)查閱,選用C18、HLB和PEP 3種SPE小柱對(duì)5種BPs衍生產(chǎn)物進(jìn)行富集(圖3):HLB柱的萃取效率更高且較穩(wěn)定,這一結(jié)果與Chi等[18]的研究結(jié)果一致, 這可能是因?yàn)镠LB吸附劑為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮[19],適用于酸性、中性和堿性化合物吸附,因而用于BPs衍生產(chǎn)物的富集具有較高且穩(wěn)定的回收率.

圖3 C18、HLB和PEP固相萃取小柱對(duì)BPs衍生產(chǎn)物回收率影響Fig.3 Effects of C18,HLB and PEP SPE cartridges on recovery rates of BPs derivatives

2.3.2 洗脫劑保留時(shí)間

固相萃取法中,洗脫劑常需在SPE小柱上停留一段時(shí)間,以便目標(biāo)物得到較好的回收率.圖4顯示:當(dāng)正己烷在SPE小柱上的停留時(shí)間為2 min時(shí),目標(biāo)物的回收率較高且穩(wěn)定.在BPs質(zhì)量濃度為4μg/m L和6μg/m L時(shí),加標(biāo)回收率分別為72.5%～112.5%和71.8%～104.0%.這可能是因?yàn)槟繕?biāo)物本身具有一定的揮發(fā)性,同時(shí)正己烷也較易揮發(fā),故停留時(shí)間長(zhǎng),可能對(duì)目標(biāo)物加標(biāo)回收率的影響更為明顯.因此,洗脫劑停留時(shí)間定為2 min較為合適.

圖4 BPs衍生產(chǎn)物回收率隨正己烷在HLB柱上停留時(shí)間的變化曲線Fig.4 Variation curve of the BPs derivatives recovery rate vs retention time of hexane(HLB)

2.4方法性能指標(biāo)

BPs標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入1.0 m L乙酸酐和1.0 m L碳酸鉀溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng),之后加入100.0 m L水樣混勻,經(jīng)活化后的HLB小柱富集,抽真空20 min,采用正己烷(保留2 min)洗脫后,收集、濃縮,經(jīng)GC/MS檢測(cè).

定量檢出限定義為噪聲信號(hào)的10倍所對(duì)應(yīng)的被測(cè)物質(zhì)質(zhì)量濃度值,定性檢出限為噪聲信號(hào)的3倍所對(duì)應(yīng)的被測(cè)物質(zhì)質(zhì)量濃度值.結(jié)果顯示:5種BPs衍生產(chǎn)物的定量檢出限為1.7～27.4 ng/m L,定性檢出限為0.8～17.7 ng/m L(表3).使用質(zhì)量濃度為2～10μg/m L的5種BPs標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng),繪制工作曲線(圖5),其線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 5,具有良好的線性關(guān)系,表明目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度在2～10μg/m L內(nèi)可以滿足定量要求.

圖5 5種BPs衍生產(chǎn)物的工作曲線Fig.5 Working curves of five BPs derivatives

表3 5種BPs衍生產(chǎn)物的檢出限Tab.3 Detection limits of five BPs derivatives

2.5 實(shí)際水樣中BPs的加標(biāo)回收率

為了評(píng)價(jià)本方法的實(shí)用性和重復(fù)性,采用市政供水和高純水為水樣,在已經(jīng)確定好的前處理方法和儀器條件下,進(jìn)行BPs的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(表4),2種質(zhì)量濃度條件下,5種BPs經(jīng)過已建立的分析方法衍生后其空白加標(biāo)回收率為93.2%～114.5%,市政供水水樣的加標(biāo)回收率為68.3%～110.1%(僅2,4,6-TBP較低,為68.3%～73.0%),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%,顯示出良好回收率和重復(fù)性.

表4 市政供水水樣中5種BPs衍生產(chǎn)物的加標(biāo)回收率Tab.4 Recoveries of five BPs derivatives in municipal water

目前,有關(guān)BPs的測(cè)定方法多用于研究土壤或生物等樣品,如李利榮等[20]針對(duì)土壤介質(zhì),利用超聲提取目標(biāo)物,凈化、濃縮后,經(jīng)GC/MS測(cè)定后,2,4,6-TBP平均加標(biāo)回收率為57.9%;徐英江等[21]采用凝膠滲透色譜凈化-乙酸酐衍生-氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中的BPs,其加標(biāo)回收率為70.2%～102%.雖然介質(zhì)不同,但BPs作為親脂性較高的有機(jī)物來說,其在土壤或生物等介質(zhì)中的含量遠(yuǎn)高于水相中,目標(biāo)物被檢出的概率相對(duì)較大.實(shí)際水樣中對(duì)溴酚經(jīng)表面活性劑輔助-凝固-漂浮分散液液微萃取,采用高效液相色譜儀檢測(cè),其加標(biāo)回收率為96.6%～105%[22],與本方法的加標(biāo)回收率近似,但此方法成本相對(duì)較高.因此,與以上已報(bào)道的分析方法相比,所建立的水中BPs測(cè)定方法的各項(xiàng)方法性能指標(biāo)還是具有一定的優(yōu)勢(shì),適于環(huán)境水樣中BPs的測(cè)定.

3 結(jié)論

針對(duì)水相中的溴酚類物質(zhì)含量少、毒性大,且尚未有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法等問題,本實(shí)驗(yàn)建立了以柱前衍生-SPE為前處理方法,GC/MS為檢測(cè)儀器的水相中痕量BPs的測(cè)定方法,探討了影響衍生化反應(yīng)和SPE 的因素,確定了較為合適的實(shí)驗(yàn)條件.所建立的以乙酸酐為衍生化試劑,HLB 小柱萃取,GC/MS檢測(cè)的分析方法中,5種BPs標(biāo)準(zhǔn)品的定性檢出限為0.8～17.7 ng/m L,空白加標(biāo)回收率為93.2%～114.5%,市政供水的加標(biāo)回收率為68.3%～110.1%(僅2,4,6-TBP較低),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%.表明該方法的靈敏度、回收率和重復(fù)性均較好,且對(duì)實(shí)際水樣也具有良好的適用性,能夠?yàn)榻窈驜Ps分析方法的優(yōu)化、檢測(cè)和監(jiān)測(cè)、削減和控制以及潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究提供參考和基礎(chǔ).