張文惠宋天歌孫瑜珊申世剛竇海洋

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071002;2.河北大學(xué) 河北省炎性自身免疫性疾病發(fā)病機制及防治重點實驗室,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)環(huán)境適應(yīng)性強,種植地域廣,營養(yǎng)豐富且兼顧保健功能,被中國列為第四大主糧化戰(zhàn)略對象[1],其全粉保留了馬鈴薯天然的味道和養(yǎng)分,凝膠化溫度低、膨脹度大、聚合度高、吸水性強、黏度和透明度高,通常被用于食品和制藥行業(yè).馬鈴薯中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)占干物質(zhì)的70%～85%,且粉質(zhì)光滑,色白澤優(yōu),糊化后呈透明膠狀,常被用于無蛋白質(zhì)烘焙、烹飪佐味料和功能性食品配料等[2].馬鈴薯淀粉的結(jié)構(gòu)影響其理化性質(zhì)和含馬鈴薯淀粉食品的品質(zhì).因此,其結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確表征對于馬鈴薯淀粉產(chǎn)品的質(zhì)量控制至關(guān)重要.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Eclipse AF4場流分離系統(tǒng)(德國Wyatt公司)在線串聯(lián)DAWN EOS多角度激光光散射檢測器(美國Wyatt公司)和1260示差折光檢測器(美國Agilent公司);馬鈴薯購自當(dāng)?shù)爻?河北,保定);疊氮化鈉(NaN3)、硝酸鈉(Na NO3)、亞硫酸氫鈉(Na HSO3)和氫氧化鈉(NaOH)購自上海麥克林生化科技有限公司;質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%鹽酸(HCl)購自北京化工廠;馬脾鐵蛋白和牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma-Aldrich公司;使用的試劑均為分析級.超純水由美國Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)制得.

1.2 馬鈴薯淀粉樣品的制備

1.2.1 馬鈴薯淀粉粗粉的提取

馬鈴薯500 g,去皮后切成小塊,添加1 g/L NaHSO3溶液后,置于山東九陽JYL-C52V型攪拌機中磨漿,漿液依次經(jīng)過80目(孔徑178μm)和200目(孔徑75μm)篩后,轉(zhuǎn)入2 L玻璃燒杯中靜置5 h,除去上清液和雜質(zhì)層.采用超純水重懸沉淀,轉(zhuǎn)入2 L玻璃燒杯后靜置3 h棄上清液,反復(fù)5次,將獲得的馬鈴薯淀粉轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中,置于上海新苗DHG-914385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中45℃烘干,轉(zhuǎn)入具塞密封管中室溫保存.

1.2.2 馬鈴薯淀粉的純化

準(zhǔn)確稱取10.0 g馬鈴薯淀粉粗粉,加入150 m L 1.8 g/L NaOH 溶液,40℃水浴中攪拌2 h(300 r/min),轉(zhuǎn)移到50 m L 離心管中,室溫6 000 r/min離心10 min,收集下層白色沉淀.加超純水調(diào)節(jié)p H 至7.00,室溫離心10 min(6 000 r/min),水洗2次后,用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗3次,無水乙醇洗2次,45℃烘干,研磨后200目(孔徑75μm)篩分,得到純化的馬鈴薯淀粉.

1.2.3 馬鈴薯淀粉的溶解

準(zhǔn)確稱取15.0 mg純化的馬鈴薯淀粉,置于20 m L螺塞玻璃瓶,加入1.5 m L NaOH 溶液(1 mol/L).室溫下,置于北京大龍MS-H550-Pro磁力攪拌器攪拌至透明無塊狀凝膠(200 r/min),轉(zhuǎn)入80℃水浴,磁力攪拌4 min(400 r/min),加入80℃的超純水使體積達(dá)到6.0 m L,繼續(xù)在80℃、400 r/min攪拌2 h,加入1.5 m L HCl溶液(1 mol/L)中和馬鈴薯溶液,繼續(xù)攪拌1 min,自然冷卻至室溫,待AF4分析[3,14].

1.3 馬鈴薯淀粉的AF4分析

AF4系統(tǒng)儀器配置和洗脫程序與張靖等[13]報道一致.使用馬脾鐵蛋白測得池道高度為287μm,使用BSA 驗證了AF4系統(tǒng)的穩(wěn)定性,具體步驟見文獻(xiàn)[13].使用ASTRA 7.1.3軟件(美國Wyatt公司)和Berry模式分析AF4數(shù)據(jù),采用0.146 m L/g為淀粉的絕對折射率增量[15].

2 結(jié)果與討論

2.1 載液離子強度對馬鈴薯淀粉回收率的影響

淀粉分子間斥力隨著載液離子強度的增加而增大,使得柔性淀粉分子的有效體積增加,進(jìn)而影響樣品的保留時間和回收率[16].在中性條件下,研究了不同離子強度NaNO3載液對馬鈴薯淀粉回收率的影響(圖1).圖1a中5 min處洗脫峰為AM,12.5 min洗脫峰是AP.結(jié)果顯示,樣品峰的分離度和保留時間隨NaNO3濃度增加而增大.不同載液離子強度下的馬鈴薯淀粉樣品的回收率列于表1.NaNO3濃度為1 mmol/L時,樣品的回收率最大(93.83±0.01)%;隨著NaNO3濃度增加(5、50、100 mmol/L),馬鈴薯淀粉的回收率逐漸降低,分別為(91.80±0.01)%、(87.77±0.02)%、(86.43±0.01)%.這主要是因為隨著載液離子強度的增加,雙電層厚度降低,樣品更接近于超過濾膜表面,導(dǎo)致樣品與超過濾膜表面交聯(lián)增大.綜合考慮樣品分離度和回收率,選擇5 mmol/L NaNO3(p H 7.00,包含3 mmol/L NaN3)作為后續(xù)AF4分析的載液.

表1 馬鈴薯淀粉在不同AF4分析條件下的回收率(n=3)Tab.1 Recovery of potato starch obtained under various AF4 run conditions(n=3)

圖1 不同離子強度下馬鈴薯淀粉的AF4-MALS-dRI圖譜、回轉(zhuǎn)半徑(a)和分子摩爾質(zhì)量(b)分布Fig.1 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different ionic strengths

2.2 樣品進(jìn)樣量對馬鈴薯淀粉回收率的影響

樣品過載不僅影響洗脫峰,而且影響樣品回收率[17].圖2為不同進(jìn)樣量的馬鈴薯淀粉AF4洗脫圖譜.馬鈴薯淀粉進(jìn)樣量為10μg 時,回收率最高(97.73±0.01)%,但AF4-MALS-d RI信號強度較弱.AF4-MALS-d RI信號強度隨馬鈴薯淀粉進(jìn)樣量的增加而增大,回收率逐漸減小.馬鈴薯淀粉進(jìn)樣量為25μg時,回收率最小(91.80±0.01)%,同時空隙峰的強度明顯增加,說明部分樣品從空隙峰中洗脫出來.此外,峰展寬增大,出現(xiàn)樣品過載現(xiàn)象.綜合考慮樣品分離度和回收率,選擇馬鈴薯樣品進(jìn)樣量為15μg作為后續(xù)AF4分析的進(jìn)樣量.

圖2 不同進(jìn)樣量下馬鈴薯淀粉的AF4-MALS-dRI圖譜、回轉(zhuǎn)半徑(a)和分子摩爾質(zhì)量(b)分布Fig.2 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different injection mass

2.3 交叉流流速對馬鈴薯淀粉回收率的影響

AF4是通過外力(交叉流)與樣品自身布朗運動產(chǎn)生的擴散力相互作用而達(dá)到分離目的.淀粉分子具有較寬的尺寸分布,使用恒定交叉流流速分離時,保留時間長,樣品與超過濾膜間交聯(lián)嚴(yán)重,導(dǎo)致樣品回收率和準(zhǔn)確性較差.該研究使用梯度洗脫模式,即AF4聚集過程結(jié)束后,交叉流流速指數(shù)衰減模式降低到0.05 m L/min(半衰期為3.0 min).在保證分離度的前提下,縮短了分析時間,減少了樣品與超濾膜之間的交聯(lián).由圖3可見,初始交叉流流速為0.8 m L/min時,馬鈴薯淀粉的分離度最小,回收率最高(96.03±0.01)%;隨著初始交叉流流速增加(1.0 mL/min),樣品層更接近于超濾膜,樣品與超濾膜交聯(lián)增強,導(dǎo)致馬鈴薯淀粉的保留時間增長,洗脫峰展寬,樣品回收率降為(94.80±0.03)%;當(dāng)初始交叉流流速為1.2 m L/min,AF4-MALS-d RI檢測的回轉(zhuǎn)半徑(radius of gyration,Rg)較0.8 m L/min時大,說明在AF4聚集過程中,馬鈴薯淀粉分子間相互作用增大,導(dǎo)致部分樣品發(fā)生聚集,此時回收率為(93.43±0.02)%.綜合考慮樣品分離度以及回收率,選擇交叉流流速為1.0 m L/min.

圖3 不同交叉流流速下馬鈴薯淀粉的AF4-MALS-dRI圖譜、回轉(zhuǎn)半徑(a)和分子摩爾質(zhì)量(b)分布Fig.3 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different cross-flow rates

2.4 聚集時間對馬鈴薯淀粉回收率的影響

在AF4分離過程中,樣品組分需要在沿通道洗脫之前達(dá)到平衡才能獲得有效的分離.為了減小樣品峰展寬,應(yīng)在樣品注入AF4通道后增加聚集時間,使樣品平衡分布層形成的條帶盡可能窄.采用溴酚藍(lán)(BPB)初步確定聚集時間.圖4為不同聚集時間馬鈴薯淀粉的AF4洗脫圖譜.隨著聚集時間的增加,馬鈴薯淀粉樣品的分離度增大,樣品回收率減小(表1).當(dāng)聚集時間為2.7 min時,樣品間的接觸時間長,導(dǎo)致部分樣品發(fā)生聚集.由表1可見,隨著聚集時間的增加(2.0、2.5、2.7 min),樣品回收率逐漸降低,分別為(98.20±0.02)%、(97.30±0.02)%和(95.87±0.02)%.綜合考慮樣品間相互作用和回收率,選擇聚集時間為2.5 min.

圖4 不同聚集時間下馬鈴薯淀粉的AF4-MALS-dRI圖譜、回轉(zhuǎn)半徑(a)和分子摩爾質(zhì)量(b)分布Fig.4 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different focusing time

2.5 方法的重復(fù)性

圖5 馬鈴薯淀粉樣品的AF4-MALS-dRI圖譜、回轉(zhuǎn)半徑(a)和分子摩爾質(zhì)量(b)分布的重復(fù)性Fig.5 Repeatability in terms of AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions for analysis of potato starch

2.6 馬鈴薯淀粉的結(jié)構(gòu)表征

圖6 馬鈴薯淀粉的分子構(gòu)象(a)、片段Ⅰ(b)、片段Ⅱ(c)、片段Ⅲ(d)Fig.6 Conformation of potato starch (a),domain Ⅰ(b),domain Ⅱ(c),domainⅢ(d)

3 結(jié)論

本文研究了在AF4 系統(tǒng)的檢出范圍內(nèi)影響樣品回收率的因素,在載液(含5 mmol/L Na NO3、3 mmol/L NaN3)p H 7.00,樣品進(jìn)樣量15μg,交叉流流速1.0 m L/min,聚集時間2.5 min的條件下,馬鈴薯淀粉的回收率為(97.30±0.02)%,提高了AF4-MALS-d RI聯(lián)用技術(shù)分離表征馬鈴薯淀粉結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性.在分子層面上,馬鈴薯淀粉的AM 的分子構(gòu)象既包括致密球形也包括柔性無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu),而AP則多為柔性線團(tuán)結(jié)構(gòu),少數(shù)為高度支化和密集堆積的結(jié)構(gòu).在分離表征馬鈴薯淀粉過程中,AF4-MALS-d RI具有良好的重復(fù)性.該研究可為馬鈴薯淀粉類食品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考.