李嬋，溫錦榮，劉昭，張國(guó)榮，王震△

（1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，陜西 西安 710065；2.西安萬(wàn)隆制藥股份有限公司，陜西 西安 710119）

混合核苷為核糖核酸經(jīng)麥芽根浸提液在酸性條件下進(jìn)行酶解所得產(chǎn)物與玉米淀粉的混合物，含胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷等多種核苷?；旌虾塑掌且曰旌虾塑諡橹魉幹瞥傻钠瑒?，臨床用于急慢性肝炎、肝損傷及肝硬化的輔助治療，也可用于因輻射及放射治療或化學(xué)治療引起的白細(xì)胞減少癥和非特異性血小板減少癥或白細(xì)胞減少癥［1-2］?，F(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中采用紫外-可見(jiàn)分光光度法控制制劑中核苷混合物的總量［3］，但檢測(cè)范圍廣，在該波長(zhǎng)處有吸收的物質(zhì)均可被檢出。在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立高效液相色譜法［4-8］，采用一測(cè)多評(píng)法實(shí)現(xiàn)多成分的質(zhì)量控制，同時(shí)解決對(duì)照品不易獲得的情況，選定合適的內(nèi)參物，根據(jù)制劑各成分間存在的線性或比例關(guān)系，建立內(nèi)參物與其他成分間的相對(duì)校正因子［9-14］，只需測(cè)定內(nèi)參物的含量，通過(guò)校正因子計(jì)算其他成分的含量。為此，本研究中建立了鳥(niǎo)嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷與內(nèi)參物腺嘌呤核苷的相對(duì)校正因子，通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定腺嘌呤核苷的含量，根據(jù)腺嘌呤核苷與其他成分間的相對(duì)校正因子計(jì)算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷的含量，并與外標(biāo)法測(cè)定的4種核糖核苷含量結(jié)果進(jìn)行比較?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030C Plus型高效液相色譜儀、島津LC-2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MS105DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司，精度為0.1 mg）；CP225D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

腺苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110879-201703，純度為99.7%）；鳥(niǎo)苷對(duì)照品（批號(hào)為T(mén)277G005，標(biāo)定純度為0.3%），胞苷對(duì)照品（批號(hào)為R088G005，標(biāo)定純度為99.4%），均購(gòu)自德國(guó)CNW Technologies GmbH 公司；尿苷對(duì)照品（Sigma -Aldrich公司，批號(hào)為BCCC2099，標(biāo)定純度為100.0%）；混合核苷片（西安萬(wàn)隆制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20057365，批號(hào)分別為181206，181207，181208，181209，181210，181211，200902，201001，201002，201003）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：迪馬Platisil ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：30%甲醇（A）-5%甲醇（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下混合對(duì)照品溶液胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷保留時(shí)間的RSD分別為0.03%，0.08%，0.11%，0.05%，峰面積的RSD分別為0.06%，0.05%，0.09%，0.19%。4 種核苷保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD均小于2.0%，表明系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果符合要求。胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的理論板數(shù)分別為8 192，10 698，15 208，144 254；分離度分別為7.128，19.965，26.910。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品20片，研細(xì)，取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于核苷混合物0.16 g），精密稱(chēng)定，置100 mL 容量瓶中，加水適量，超聲處理10 min 使提取完全，用水稀釋并定容，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為3 500 r/ min）10 min，精密量取上清液5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用水釋?zhuān)瑩u勻并定容，0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

混合對(duì)照品溶液：取胞嘧啶核苷對(duì)照品15 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加水使溶解并定容，搖勻，作為胞嘧啶核苷對(duì)照品母液（質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL）。分別取尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷對(duì)照品11.5 mg，精密稱(chēng)定，分別置25 mL 容量瓶中，加水使溶解并定容，搖勻，作為尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷對(duì)照品母液（質(zhì)量濃度均為0.46 mg/mL）。分別精密量取上述4 種核苷對(duì)照品母液各1.0 mL，置50 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例制備不含混合核苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備相應(yīng)的陰性對(duì)照品溶液。

對(duì)照品定位溶液：精密量取上述4種核苷對(duì)照品母液各1.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品定位溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各成分與相鄰組分分離較好。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察、檢測(cè)限與定量限確定：分別精密量取2.2 項(xiàng)下核苷對(duì)照品母液1.0 mL，置25 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，作為線性溶液6；分別精密量取上述溶液1，2，3，5，8 mL，置10 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，分別作為線性溶液1-5。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，詳見(jiàn)表2。取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)孕旁氡确謩e為10∶1和3∶1 的質(zhì)量濃度計(jì)算定量限和檢測(cè)限。按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系考察、定量限與檢測(cè)限確定結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOQ and LOD

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201001）適量，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的平均含量分別為2.30%，6.03%，6.62%，9.10%，RSD分別為1.40%，0.63%，0.88%，0.44%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液6份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的含量，平均含量分別為2.28%，6.12%，6.58%，9.01%，RSD分別為1.80%，1.60%，0.92%，1.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，5，9，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷峰面積的RSD分別為1.6%，0.58%，0.79%，0.50%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取胞嘧啶核苷對(duì)照品30 mg、鳥(niǎo)嘌呤核苷對(duì)照品75 mg、尿嘧啶核苷對(duì)照品75 mg、腺嘌呤核苷對(duì)照品115 mg，精密稱(chēng)定，分別置100 mL容量瓶中，加水溶解、稀釋并定容，搖勻，作為各個(gè)成分的回收率對(duì)照品母液。取樣品（批號(hào)為201001）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于核苷混合物0.08 g），精密稱(chēng)定，分別加入上述回收率對(duì)照品母液4，5，6 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積。計(jì)算得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的回收率分別為99.4%，99.1%，100.5%，99.9%，RSD分別為0.83%、0.28%，0.81%，0.63%（n=9），表明結(jié)果準(zhǔn)確度良好。

耐用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液與供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件采用不同色譜儀、色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，記錄各成分的峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的標(biāo)示含量。與2.1 項(xiàng)下色譜條件比較，不同色譜儀和色譜柱所得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的標(biāo)示含量的變化率分別為1.20%，0.25%，1.50%，0.23%，4 種成分標(biāo)示含量總和的變化率為0.83%，均小于2.0%，表明方法耐用性良好。

2.4 相對(duì)校正因子（fs/i）

fs/i的建立：根據(jù)公式fs/i=（As×Ci）/（Ai×Cs）計(jì)算一測(cè)多評(píng)的fs/i［14］。式中，As代表內(nèi)參物腺嘌呤核苷峰面積，Cs代表內(nèi)參物腺嘌呤核苷質(zhì)量濃度，Ai代表其他組分峰面積，Ci代表其他組分濃度。以腺嘌呤核苷為內(nèi)參物，計(jì)算腺嘌呤核苷與胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷的fs/i分別為1.84，1.40，1.25，RSD分別為0.22%，1.75%，0.41%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷與腺嘌呤核苷的相對(duì)校正因子Tab.3 RCFs of cytidine，uridine and guanosine relative to adenosine

不同高效液相色譜系統(tǒng)和色譜柱對(duì)fs/i的影響：分別用Waters 2695、島津LC -2030C Plus 2 種高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，考察了迪馬Platisil ODS 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和InertsilTMODS -3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）對(duì)fs/i的影響，各成分在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱上fs/i的RSD均小于5.0%［15］。詳見(jiàn)表4。

表4 不同色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different chromatographs and chromatographic columns on the RCFs

2.5 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

取10 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定各成分的峰面積。以腺嘌呤核苷為內(nèi)參物，計(jì)算腺嘌呤核苷與其他3種成分的fs/i，并通過(guò)fs/i計(jì)算各自的標(biāo)示含量。以外標(biāo)法計(jì)算4 種成分的標(biāo)示含量，并對(duì)比2 種方法所測(cè)得結(jié)果的差異。結(jié)果見(jiàn)表5。外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法所測(cè)得結(jié)果的RSD均小于5.0%，差異無(wú)顯著性，表明一測(cè)多評(píng)法可用于混合核苷片中多種成分含量的測(cè)定。

表5 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果比較（%）Tab.5 Comparison of content determination of four components in Mixed Nucleoside Tablets by the ESM and the QAMS（%）

3 討論

混合核苷片中主要有效成分為胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷等，其中腺嘌呤核苷對(duì)照品易得，性質(zhì)較穩(wěn)定。故選擇腺嘌呤核苷為內(nèi)參物?；旌虾塑掌续B(niǎo)嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷均易溶于水。水作提取溶劑具有干擾小、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)［16］。故選擇水提法。本研究中，供試品溶液于200～400 nm 波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描，于257.8 nm 波長(zhǎng)處有最大紫外吸收，且空白輔料溶液在此范圍內(nèi)無(wú)紫外吸收。參考現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法，選擇260 nm作為最終吸收波長(zhǎng)。

綜上所述，一測(cè)多評(píng)法可用于測(cè)定混合核苷片中多種成分的含量，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。