張樹萌， 李錦蓮， 郭曉玲， 孟令仁， 周 實

(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

胸腺嘧啶和胞嘧啶是兩種重要的嘧啶分子， 存在于脫氧核糖核酸(DNA)中并參與細(xì)胞嘧啶核苷酸的代謝， 可調(diào)控血流、 預(yù)防心律失常、 抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放并調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性[1-2]. 胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量是診斷癌癥、 艾滋病、 心肌細(xì)胞能量狀態(tài)、 疾病治療進(jìn)展評價的重要參數(shù)[3-4]. 由于核苷酸、 核苷及其堿基的定量檢測在生物醫(yī)學(xué)、 生理學(xué)和臨床研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛， 因此測定胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量或它們在DNA中的比例已引起人們廣泛關(guān)注[5]. 生物樣品中胸腺嘧啶和胞嘧啶定量分析的常用方法有高效液相色譜法(HPLC)[6]、 質(zhì)譜法(MS)[7]、 凝膠電泳法[8]等. 但在實際應(yīng)用中存在樣品前處理復(fù)雜、 儀器昂貴、 不便攜帶、 需要衍生或需結(jié)合其他檢測方法等問題. 電化學(xué)分析法[9-13]具有較高的靈敏度、 重現(xiàn)性、 簡便性、 樣品前處理簡單、 成本低、 可實時檢測等優(yōu)點. 其中， 基于嘌呤核苷酸代謝的細(xì)胞電化學(xué)法已用于評價環(huán)境雌激素效應(yīng)、 檢測典型環(huán)境污染物(重金屬、 氯酚類)的細(xì)胞毒性等[14-15].

文獻(xiàn)[16]制備了氧化石墨烯量子點/多壁碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷電極(GOQDs/MWCNTs/SPCE*)， 構(gòu)建微型反應(yīng)裝置， 在較寬的電位窗下實現(xiàn)了尿酸與嘌呤的同時檢測. 本文利用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的電化學(xué)檢測方法對胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同時檢測， 考察最佳檢測條件， 研究電極對兩種嘧啶分子的選擇性和靈敏度， 實現(xiàn)電化學(xué)法同時測定小鼠胚胎成纖維(BALB/c 3T3)細(xì)胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶， 為嘧啶分子的靈敏快速檢測提供新技術(shù)方法.

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/c 3T3， 中科院上海細(xì)胞庫); DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium， 美國Gibco公司); 氧化石墨烯量子點(GOQDs， 南京先豐納米材料科技有限公司); 高純多壁碳納米管(MWCNTs， 深圳納米港有限公司); 尿酸(UA)， 黃嘌呤(X)， 鳥嘌呤(G)， 腺嘌呤(A)， 次黃嘌呤(HX)， 胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)均購自美國Sigma公司; 其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

恒電位儀(CHI 660型， 上海辰華儀器有限公司); 絲網(wǎng)印刷電極(SPCE， SE100型， 臺灣地區(qū)Zensor R&D公司); 高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1311Agilent 1100型， 德國安捷倫科技有限公司); 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(311型， 美國Thermo公司); 倒置熒光顯微鏡(CKX41型， 日本Olympus公司); 培養(yǎng)皿(D8054型， 美國Sigma公司); 培養(yǎng)板(3603型， 美國Corning公司); 超潔凈工作臺(VS-1300U型， 蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與收集

細(xì)胞在含10%胎牛血清、 1% 100 μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、 φ(CO2)=5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 除去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基， 加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS)于水浴鍋中, 50 ℃裂解后進(jìn)行電化學(xué)檢測[8].

1.3 電化學(xué)檢測方法

GOQDs/MWCNTs/SPCE*的制備過程參照文獻(xiàn)[16]， 在電化學(xué)分析儀上， 用微分脈沖伏安(DPV)法于25 ℃進(jìn)行電化學(xué)檢測， 三電極體系包括GOQDs/MWCNTs/SPCE*工作電極， Ag/AgCl/KClsat參比電極和鉑絲對電極.

1.4 高效液相色譜檢測

檢測條件： Ascenis RP-Amide型色譜柱(4.0 mm × 250 mm × 5.0 μm); 檢測波長： 254 nm; 柱溫： 25 ℃; 流動相： 0.02 mmol/L pH=4.9的KH2PO4溶液; 流動相流速： 1.0 mL/min; 進(jìn)樣量： 20 μL. 樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣檢測.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Origin 2018軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)行為

用已構(gòu)建的電化學(xué)檢測系統(tǒng)[16]對胸腺嘧啶(50 μmol/L)和胞嘧啶(100 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測， 兩種混合物在不同電極上的DPV曲線如圖1所示. 對比5個電極， GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極在1.15，1.30 V處有2個明顯的電化學(xué)信號， 分別歸屬于胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰. 由圖1可見， GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極對胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)響應(yīng)較強.

2.2 富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號的影響

富集電位、 富集時間和pH值等因素均影響電極對樣品的檢測效率. 為研究富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶在GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極上電化學(xué)行為的影響， 在不同富集電位(-0.3，-0.2，0，0.2，0.3 V)下測定胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)樣品的電化學(xué)信號， 富集時間為360 s， 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見， 富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電流影響較小. 因此， 選取0為最佳富集電位.

圖1 胸腺嘧啶和胞嘧啶混合物在不同電極上的DPV曲線

圖2 富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電流的影響

2.3 富集時間對胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號的影響

圖3 富集時間對胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電流的影響

圖3為不同富集時間下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)樣品的電化學(xué)曲線， 富集時間分別為0,90,150,240,300 s. 由圖3可見， 隨著富集時間的增加， 氧化峰電流小幅度增加， 150 s后峰電流隨富集時間的增加基本無變化. 這可能是富集150 s時， 樣品在電極表面上的吸附達(dá)到了飽和狀態(tài)， 因此選取150 s為最佳富集時間.

2.4 pH值對胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號的影響

圖4為不同pH值(5.90，6.58，7.40，8.66，9.50，10.55)下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)的氧化峰電位和氧化峰電流的變化. 由圖4(A)可見， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電位隨pH值的增加而負(fù)移， 表明質(zhì)子參與了電化學(xué)反應(yīng)[14]. pH值與峰電位呈一定的線性關(guān)系， 線性方程分別為

ET= 1.509 9-0.049 0pH (R2= 0.990 8)，

EC= 1.534 7-0.034 6pH (R2=0.990 6).

兩個方程的斜率值分別為0.049 0，0.034 6， 與理論值0.059，0.029接近， 表明胸腺嘧啶和胞嘧啶在電極表面分別發(fā)生了兩電子和單電子的氧化反應(yīng)[15]. 由圖4(B)可見， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的峰電流隨pH值的減小而增加， 當(dāng)pH=7.4時， 電極對胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)響應(yīng)較強， 且細(xì)胞的生理pH=7.4， 因此選取pH=7.4為檢測條件.

2.5 GOQDs/MWCNTs/SPCE*的選擇性和靈敏度

為考察基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的檢測系統(tǒng)對胸腺嘧啶和胞嘧啶混合溶液的選擇性， 在最佳檢測條件下， 通過改變一種物質(zhì)濃度而另一種物質(zhì)濃度保持不變繪制電化學(xué)曲線， 結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見， 隨著待測物質(zhì)濃度的增加， 其氧化峰電流增加， 而濃度保持不變的另一種物質(zhì)的電化學(xué)信號沒有變化. 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的微檢測系統(tǒng)可靈敏檢測到胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號的變化， 分別在5～340 μmol/L和5～430 μmol/L內(nèi)， 兩種物質(zhì)的濃度與氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系. 對應(yīng)的線性方程分別為

IT=17.138 0+0.157 9c(R2=0.996 8)，

IC=34.749 2+0.135 18c(R2=0.998 6)，

且最低檢測限分別為0.69，0.95 μmol/L.

圖4 pH值對胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電位(A)及氧化峰電流(B)的影響

(A) a～l: c(T)=5,25,50,85,110,140,185,220,240,270,310,340 μmol/L; (C) a～m: c(C)=5，25，50，75，100，120，180，230，280，320，360，390，430 μmol/L.

2.6 細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的檢測

高效液相色譜(HPLC)法常用于定量檢測生物小分子[7]. 將BALB/c 3T3細(xì)胞懸浮液及加入尿酸、 黃嘌呤、 鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶的細(xì)胞懸浮液用HPLC法進(jìn)行對比， 結(jié)果如圖6所示， 其中測試細(xì)胞的濃度為每毫升106個細(xì)胞. 由圖6可見， 胞嘧啶和胸腺嘧啶的保留時間分別為4.20，13.32 min. 利用內(nèi)標(biāo)法檢測加入的7種標(biāo)準(zhǔn)品， 只有6個信號發(fā)生變化. 原因是細(xì)胞中還存在大量嘌呤， 胸腺嘧啶與黃嘌呤的出峰位置接近且無法分離(圖6(B))， 因此用HPLC法無法同時檢測到BALB/c 3T3細(xì)胞中胞嘧啶和胸腺嘧啶的出峰位置， 僅能檢測到胞嘧啶.

紅線： BALB/c 3T3細(xì)胞懸浮液; 黑線： 細(xì)胞懸浮液和尿酸、 黃嘌呤、 鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶混合物.

用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的細(xì)胞電化學(xué)法對BALB/c 3T3細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測， 結(jié)果如圖7所示. 由圖7可見， 在細(xì)胞裂解液中檢測到位于0.28，0.65，0.92，0.97 V處存在4個電化學(xué)信號[17-18]. 與尿酸和嘌呤標(biāo)準(zhǔn)樣品對比， 4個電化學(xué)信號分別歸屬于細(xì)胞中尿酸、 黃嘌呤/鳥嘌呤、 腺嘌呤和次黃嘌呤的氧化. 細(xì)胞裂解液中檢測到位于1.15，1.30 V處的2個電化學(xué)信號歸屬于細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化. 可見， 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的細(xì)胞電化學(xué)法可實現(xiàn)細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同時檢測.

紅線： BALB/c 3T3細(xì)胞； 黑線： 尿酸、 黃嘌呤/鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品混合物.

綜上所述， 本文用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的電化學(xué)檢測方法考察了富集電位、 富集時間、 pH值等因素對胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品電化學(xué)行為的影響， 獲得最佳檢測條件為富集電位0， 富集時間150 s， pH=7.4; 電極對胸腺嘧啶和胞嘧啶的最低檢測限分別為0.69，0.95 μmol/L. 該方法實現(xiàn)了BALB/c 3T3細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同時靈敏檢測， 為生物樣品中嘧啶分子的靈敏快速檢測提供了一種新技術(shù)方法.