趙安社，王新陸，朱明軍，曹英杰，喬利杰，鄭超楠

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

《中華人民共和國藥典》記載：黃芪，甘、溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效，中醫(yī)古籍大多把它歸為補(bǔ)益藥中的補(bǔ)氣藥。黃芪具有利尿作用，防己黃芪湯、黃芪桂枝五物湯、桂枝加黃芪湯、黃芪芍藥桂枝苦酒湯等方劑常用于治療水腫，包括心源性水腫、腎病綜合征水腫、黃斑水腫、腦水腫、外科手術(shù)水腫等[1-4]。通過分析名老中醫(yī)醫(yī)案，治療水腫從“脾”論治，推測(cè)黃芪的功效為益氣、健脾、補(bǔ)虛?！墩渲槟摇份d黃芪“甘溫純陽、補(bǔ)諸虛、益元?dú)?、活血生血”?！侗窘?jīng)逢原》謂黃芪“性雖溫補(bǔ)，而能通調(diào)血脈，流行經(jīng)絡(luò)”，說明黃芪非為純補(bǔ)呆滯之品，而是以益氣補(bǔ)虛之效，行通脈活血之用，對(duì)氣虛血瘀之證而言，可謂兩擅其功[5]。含黃芪的治療水腫的方劑中，黃芪除了具有益氣活血功效之外，是否同時(shí)具有利尿作用及發(fā)揮利尿作用的可能成分尚不清楚?；诖?，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪治療水腫的作用機(jī)制

1.1 資料與方法

1.1.1 藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)及PubChem數(shù)據(jù)庫檢索黃芪的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18%為條件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選，得到黃芪的活性成分，并通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取黃芪活性成分的標(biāo)準(zhǔn)Smiles結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中對(duì)活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并以Probability≥30%為條件進(jìn)行篩選。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得黃芪活性成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)，與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲得的作用靶點(diǎn)進(jìn)行整合，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2 水腫相關(guān)靶點(diǎn)及黃芪治療水腫的潛在靶點(diǎn)的獲取在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)與人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)中以“edema”為關(guān)鍵詞對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取-IgP>5的靶點(diǎn)，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將黃芪活性成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)與水腫相關(guān)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Veney2.1軟件進(jìn)行映射，并繪制韋恩圖，獲取黃芪活性成分靶點(diǎn)與水腫相關(guān)靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)，即為黃芪治療水腫的潛在靶點(diǎn)。

1.1.3 “活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將黃芪活性成分與潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)中，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值≥0.90，并隱藏游離節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心基因。

1.1.5 富集分析將黃芪治療水腫的相關(guān)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2 結(jié)果

1.2.1 藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)基于TCMSP及PubChem數(shù)據(jù)庫檢索黃芪的化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18%為條件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選后，共得到黃芪的活性成分20個(gè)。雖然黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ及甜菜堿的DL較低，但文獻(xiàn)研究顯示這些成分有明顯的利尿作用，也納入后續(xù)研究。將25個(gè)黃芪活性成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)靶點(diǎn)，并與TCMSP數(shù)據(jù)庫中所得靶點(diǎn)合并，共獲得248個(gè)黃芪活性成分作用靶點(diǎn)。見表1。

表1 黃芪活性成分信息表

1.2.2 水腫相關(guān)靶點(diǎn)及黃芪治療水腫的潛在靶點(diǎn)檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出-IgP>5的靶點(diǎn)，共得到710個(gè)水腫相關(guān)靶點(diǎn)。將248個(gè)黃芪活性成分作用靶點(diǎn)與710個(gè)水腫相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Veney2.1軟件，繪制韋恩圖，取交集，最終獲得黃芪活性成分與水腫的共同作用靶點(diǎn)79個(gè)，即為黃芪治療水腫的潛在靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)韋恩圖

1.2.3 “活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將25個(gè)藥物活性成分與79個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行映射，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中圓形代表活性成分，方形代表潛在靶點(diǎn)，從圖中可知，該網(wǎng)絡(luò)共包括95個(gè)節(jié)點(diǎn)、175條邊。因黃芪25個(gè)活性成分中有10個(gè)成分未找到與此對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)，因此圖中只顯示15個(gè)活性成分，其中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的成分為槲皮素、山柰酚、7-O-methylisomucronulatol、芒柄花素、毛蕊異黃酮。結(jié)合已報(bào)道的基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點(diǎn)數(shù)目及相關(guān)性，選取芒柄花素、毛蕊異黃酮進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究。見圖2。

圖2 “活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)將79個(gè)黃芪治療水腫的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行分析，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。此網(wǎng)絡(luò)有79個(gè)節(jié)點(diǎn)、225條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為5.7，其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，邊代表蛋白與蛋白之間相互作用關(guān)系，邊數(shù)代表關(guān)聯(lián)度的大小。富集P<1.0×10-16的靶點(diǎn)，平均度值為31.418，選取度值大于平均值的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，共41個(gè)，涉及蛋白激酶Bα(probein kinase Bα，AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、腫瘤壞死因子(tumor necrotic factor，TNF)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3 kinase adaptor，PIK3CA)等。見圖3。

圖3 黃芪利水作用核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

1.2.5 GO功能富集分析將79 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)3 個(gè)分支。設(shè)定閾值P<0.05，共富集到生物過程464個(gè)條目，涉及NO生物合成過程的正調(diào)控、炎癥、凋亡、雌二醇、應(yīng)對(duì)缺氧、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等；細(xì)胞組分45個(gè)條目，涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、受體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)等；分子功能77個(gè)條目，涉及細(xì)胞因子活性、蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、serine-type肽鏈內(nèi)切酶活性、血紅素結(jié)合、生長因子活性、蛋白同二聚活動(dòng)等。篩選排名前10位的生物過程、分子功能和細(xì)胞組分，用GraphPad Prism 5.0繪圖。見圖4。

圖4 GO功能富集分析

1.2.6 KEGG通路富集分析對(duì)篩選得到的 79 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，設(shè)定閾值P<0.05，共富集得到106條通路，主要涉及TNF 信號(hào)通路(16個(gè)靶點(diǎn))、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路(13個(gè)靶點(diǎn))、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT信號(hào)通路(20個(gè)靶點(diǎn))、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor，F(xiàn)oxO)信號(hào)通路(12個(gè)靶點(diǎn))、p53信號(hào)通路(9個(gè)靶點(diǎn))、鞘脂(sphingolipid)信號(hào)通路(11個(gè)靶點(diǎn))、T細(xì)胞受體(T cell receptor)信號(hào)通路(10個(gè)靶點(diǎn))等。說明黃芪主要活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的代謝通路，多成分、多靶點(diǎn)相互調(diào)節(jié)是黃芪治療水腫的可能作用機(jī)制。選擇前20條信號(hào)通絡(luò)通過Omicshare軟件制作高級(jí)氣泡圖。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

2 黃芪及其活性成分的利水作用研究

2.1 材料

2.1.1 動(dòng)物54只6～8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)2015-0005。動(dòng)物每籠4只，飼養(yǎng)在22 ℃、40%濕度的環(huán)境下，自由飲食進(jìn)水。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：YFYDW2020007)。

2.1.2 藥物與試劑黃芪(北京同仁堂藥店)；呋塞米片(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：HB2021428)。芒柄花素、毛蕊異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：B20836、B20847)。

2.1.3 儀器馮氏DXL-D型代謝籠(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)；Waterse26995型高效液相色譜儀、2998型紫外檢測(cè)器、Empower化學(xué)工作站(美國沃特世公司)；Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國奧泰公司)；CF225D型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))。

2.2 方法

2.2.1 藥物制備100 g黃芪經(jīng)清洗、去除雜質(zhì)、烘干后質(zhì)量共計(jì)81.3 g。加10倍量水煎煮三次，每次1 h，合并煎煮液，濾過，濾液減壓濃縮得凍干粉26.33 g，使用時(shí)用超純水進(jìn)行配制。

2.2.2 HPLC測(cè)定浸膏中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量適量浸膏粉末過四號(hào)篩后，精密稱取0.2 g，置具塞錐形瓶中，加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液50 mL，超聲30 min，用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液 25 mL，蒸干后用80%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)波長260 nm，以AB=乙腈0.3%甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫。洗脫程序?yàn)?～20 min，10%～30% A；20～25 min，30% A；25～35 min 30%～60%A。毛蕊異黃酮與芒柄花素分離度良好。外標(biāo)曲線法計(jì)算樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量[6]。

2.2.3 水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)相關(guān)方法參照2000年人民衛(wèi)生出版社出版的《中藥藥理研究方法學(xué)》。將大鼠置于代謝籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)48 h后，禁食不禁水18 h，稱質(zhì)量，按照50 mL·kg-1的劑量灌胃給予生理鹽水，進(jìn)行水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)。30 min后，按摩腹部排空膀胱尿液，將54只大鼠隨機(jī)分為正常組、黃芪小劑量組、黃芪大劑量組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、呋塞米組，每組9只。依照黃芪相關(guān)方劑臨床常用劑量，結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，黃芪劑量分為 60 g、30 g兩個(gè)劑量，根據(jù)人與大鼠體表面積進(jìn)行換算，黃芪大、小劑量組大鼠的給藥劑量分別為 2.3 g·kg-1及1.15 g·kg-1。芒柄花素組、毛蕊異黃酮組的灌胃劑量根據(jù)浸膏中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量進(jìn)行計(jì)算。選擇呋塞米作為陽性對(duì)照藥，經(jīng)換算后給藥劑量為4.6 mg·kg-1。按照 10 mL·kg-1的劑量灌胃給予相應(yīng)實(shí)驗(yàn)用藥，正常組灌入同等容積的生理鹽水，分別收集灌胃后0～2 h、2～4 h、4～6 h、7～24 h內(nèi)的大鼠尿液，共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每次每組3只大鼠，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 結(jié)果

2.3.1 浸膏中芒柄花素和毛蕊異黃酮含量結(jié)果顯示，芒柄花素的含量為5 545.674 μg·g-1，毛蕊異黃酮的含量為39.66 μg·g-1。根據(jù)高效液相的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算得出，芒柄花素和毛蕊異黃酮組大鼠的灌胃劑量分別為9.2 mg·L-1、1.3 g·L-1。見圖6。

圖6 黃芪樣品中芒柄花素、毛蕊異黃酮含量檢測(cè)色譜圖

2.3.2 黃芪及芒柄花素、毛蕊異黃酮的利水作用與正常組比較，灌胃后0～2 h、2～4 h及0～6 h內(nèi)呋塞米組、黃芪小劑量組及毛蕊異黃酮組的尿量顯著增多(P<0.05)；灌胃后4～6 h內(nèi)呋塞米組、黃芪小劑量組、黃芪大劑量組及芒柄花素組的尿量顯著增多(P<0.05)；灌胃后7～24 h內(nèi)黃芪小劑量組、毛蕊異黃酮組大鼠的尿量明顯增加(P<0.05)。提示黃芪小劑量、毛蕊異黃酮具有長效利尿的作用。見表2。

表2 黃芪及主要活性成分對(duì)大鼠尿量的影響

3 討論

黃芪，豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，別名綿芪或綿黃芪，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“耆，長也?！秉S耆色黃，為補(bǔ)藥之長，故名黃耆，今俗作黃芪。以山西、內(nèi)蒙古武川等地所稱為北芪者，質(zhì)地好，為正品。戴瑜婷等[6]指出黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效，臨床用于治療氣虛乏力、納差便溏、中氣下陷、肢腫尿少、氣虛血滯、痹痛麻木等。古代醫(yī)家常用黃芪配伍不同中藥治療虛勞、血痹、歷節(jié)病、黃汗、黃疸、表虛不固之風(fēng)水或風(fēng)濕痹證等[7]。醫(yī)圣張仲景在《金匱要略·痙濕暍病脈證并治》云：“風(fēng)濕，脈浮身重，汗出惡風(fēng)者，防己黃芪湯主之?！敝伪硖摑癖宰C，取防己黃芪湯，以黃芪 30 g 配伍防己 15 g，固表祛風(fēng)以行水，常加土茯苓、豨薟草利水滲濕，忍冬藤、青風(fēng)藤、海桐皮祛風(fēng)利濕[7]。王暴魁教授參考《冷廬醫(yī)話》治療水腫案中黃芪的用量(四兩)及補(bǔ)陽還五湯中黃芪的用量(四兩)，并結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗(yàn)，主張采用大劑量生黃芪治療水腫及蛋白尿，并根據(jù)病情輕重、患者體質(zhì)量、患者服用后的反應(yīng)等調(diào)整用量[8]。黃煌指出：“黃芪主治汗出而腫[9]?！弊院蛊に?、風(fēng)濕身重者用黃芪，以其利水[10]。

水腫是內(nèi)科常見病，指體內(nèi)水液滯留，泛溢肌膚，以眼瞼、頭面、四肢、腹背甚至全身浮腫為特征，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中水腫病名眾多，包括腎風(fēng)、風(fēng)水、水腫、溢飲、石水、涌水等，主要病機(jī)為臟腑功能失調(diào)致陽氣阻遏，氣化失司，聚水為水腫[11]?！端貑枴乎蝉氛摗吩疲骸叭ネ痍惽s，微動(dòng)四極，溫衣，繆刺其處，以復(fù)其形；開鬼門，潔凈府……[12]”提出水腫的治療有“開鬼門”“潔凈府”“去菀陳莝”三條基本原則，即發(fā)汗，利小便，攻下逐水、通利大便。張志聰謂積者謂之宛，久者謂之陳，宛陳謂之積久之水邪，莖謂之雜草，二者喻指體內(nèi)積久水邪與久病疲血，“去宛陳莝”指的就是去除體內(nèi)積久痕滯之物[13]。朱麗穎等總結(jié)了《金匱要略》中關(guān)于四水的癥狀及治療用方，將四水治療方劑分為以防己黃芪湯與越婢湯為代表方劑的兩類，方為綱體現(xiàn)出從肺論治及從脾論治兩大治療體系[14]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，引起水腫的主要原因?yàn)檠軆?nèi)外液體交換平衡失衡及體內(nèi)外液體交換平衡失衡，水鈉潴留是引起體內(nèi)外液體交換平衡失衡的主要原因，心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)分泌減少及腎小管對(duì)ANP的利尿作用抵抗，血管加壓素(arginine vasopressin，AVP)或抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)分泌增加、醛固酮分泌增多等，均可引起腎小球?yàn)V過率下降、腎小管對(duì)水鈉重吸收增加，引起水鈉潴留，最終導(dǎo)致水腫[15-18]。

針對(duì)水腫患者，除積極治療原發(fā)病之外，服用利尿劑是最常用的治療方法，也往往能夠起到立竿見影的效果，但對(duì)于一些慢性疾病，尤其是心源性疾病引起的水腫，需長期服用利尿劑，以改善水鈉潴留、緩解心衰癥狀、延緩心衰進(jìn)展，但利尿劑抵抗是不能忽視的一個(gè)問題，有研究顯示，約有1/3的心衰患者存在利尿劑抵抗的問題[19]，目前常用的利尿劑，包括袢利尿藥、噻嗪類利尿藥和保鉀利尿藥三類，其中袢利尿藥效果最強(qiáng)，有明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，作用靶點(diǎn)相對(duì)單一，利尿效果明顯，臨床應(yīng)用廣泛。但長期服用利尿劑，不僅會(huì)引起電解質(zhì)紊亂，利尿效果逐漸減弱也是不爭(zhēng)的事實(shí)，同時(shí)會(huì)引起口干而增加飲水次數(shù)，繼而引起嚴(yán)重鈉潴留，再次形成引發(fā)水腫的機(jī)體內(nèi)環(huán)境[20]。

中藥成分復(fù)雜，多種成分多途徑、多靶點(diǎn)共同發(fā)揮作用，能很好地解決單一靶點(diǎn)抵抗問題，并已廣泛應(yīng)用于臨床，但同時(shí)多種成分的交互作用、靶點(diǎn)的相互關(guān)聯(lián)，也給研究帶來了一定的困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在疾病、基因、靶點(diǎn)與藥物相互作用的網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析系統(tǒng)地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的影響，從而揭示多分子藥物協(xié)同作用的新學(xué)科，具有整體、協(xié)同和動(dòng)態(tài)的特點(diǎn)[21]，這一特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)“整體觀”和“辨證施治”的觀點(diǎn)不謀而合。針對(duì)確定中藥及中藥復(fù)方活性成分、中醫(yī)癥候的研究，闡明配伍規(guī)律、解釋方劑-癥候關(guān)系和復(fù)方優(yōu)化尋找新藥等方面具有一定優(yōu)勢(shì)[22-23]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的主要成分包括皂苷類(黃芪皂苷甲、乙、丙等)、黃酮類(芒柄花素，毛蕊異黃酮，3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷等)、氨基酸類(8-氨基丁酸、天冬酰胺等)、多糖類(鼠李糖、蔗糖、葡萄糖醛酸等)以及膽堿、香菜堿、香豆素等[24]。研究表明，黃芪利水作用功效可能與調(diào)節(jié)水與電解質(zhì)平衡、調(diào)控水通道蛋白、保護(hù)腎臟微組織結(jié)構(gòu)、修復(fù)黏膜損傷、糾正腸道菌群微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡等作用有密切聯(lián)系[25]。汪賢聰?shù)妊芯堪l(fā)現(xiàn)黃芪通過顯著改善腎病綜合征患者精氨酸AVP系統(tǒng)提高腎小球?yàn)V過率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其利尿作用[26]。張永娜等[27]研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可明顯促進(jìn)水負(fù)荷模型大鼠尿液中Na+、Cl-的排泄，未發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對(duì)尿液中K+的排泄與尿液pH值有影響。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%、DL≥0.18%為條件，篩選出黃芪共20個(gè)活性成分，結(jié)合文獻(xiàn)查閱，共得到25個(gè)活性成分。通過Veney2.1軟件獲取79個(gè)黃芪藥物成分與水腫共同作用靶點(diǎn)，涉及的活性成分共14個(gè)，涉及最多的成分為黃酮類(芒柄花素、毛蕊異黃酮、檞皮素、異鼠李素、二氫異黃酮、山柰酚)、皂苷類(常春藤皂苷元、甜菜堿)、氨基酸類(葉酸)，靶點(diǎn)最多、相關(guān)度最高的為黃酮類，主要為槲皮素、7-O-methylisomucronulatol、山柰酚、芒柄花素、毛蕊異黃酮。結(jié)合文獻(xiàn)研究、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點(diǎn)數(shù)目及相關(guān)性，本研究選取刺芒柄花素、毛蕊異黃酮進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究。

通過大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芪小劑量具有明顯的利尿作用，利尿強(qiáng)度弱于呋塞米片，但作用持久，持續(xù)觀察24 h發(fā)現(xiàn)，前6 h呋塞米組尿量明顯增加，7～24 h尿量增加不明顯；黃芪小劑量組0～6 h、7～24 h兩個(gè)時(shí)間段尿量均增加，且較正常組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芪大劑量組前6 h尿量明顯減少，且尿液顏色明顯變黃，7～24 h尿量與正常組相當(dāng)。毛蕊異黃酮組、芒柄花素組0～6 h、7～24 h 兩個(gè)時(shí)間段尿量均增加，毛蕊異黃酮組尿量增加更明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此研究證實(shí)，黃芪具有利尿作用，并且與劑量有關(guān)系，黃芪30 g利尿作用明顯，黃芪60 g尿量較正常組減少，主要利尿作用可能與毛蕊異黃酮、芒柄花素相關(guān)，需進(jìn)一步研究證實(shí)。雷根平受《冷廬醫(yī)話》中“芪米湯”一案啟發(fā)，經(jīng)臨床多年實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，對(duì)于各種原因引起的水腫，凡屬氣虛，僅重用黃芪一味即可達(dá)到利尿功效，此功效需用量在 90 g 以上方能見明顯療效。視水腫之嚴(yán)重程度，大劑量可用至100～200 g，超大劑量可至300 g，稱之為“獨(dú)芪湯”[28]?，F(xiàn)代患者大多以慢性病為主，病情周期長，加之大多藥物采用人工種植，藥力較古時(shí)相差較大；且患者期望值亦普遍較高[29]?！爸嗅t(yī)不傳之秘在于量”，因此有關(guān)劑量的應(yīng)用還需進(jìn)一步研究，找到黃芪最佳利尿效果的使用劑量。

通過KEGG通路富集分析及GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，生物過程涉及NO生物合成過程的正調(diào)控、炎癥、凋亡、雌二醇、應(yīng)對(duì)缺氧、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等；細(xì)胞組分涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、受體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)等；細(xì)胞組分涉及細(xì)胞因子活性、蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、serine-type肽鏈內(nèi)切酶活性、血紅素結(jié)合、生長因子活性、蛋白同二聚活動(dòng)等方面。黃芪抗水腫靶點(diǎn)主要涉及TNF信號(hào)通路、HIF-1、PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、Sphingolipid信號(hào)通路、T cell receptor等信號(hào)通路。水腫是多種疾病的并發(fā)癥狀，包括心力衰竭、腎功能不全、風(fēng)濕免疫相關(guān)疾病等?！端貑枴そ?jīng)脈別論》中“飲入于胃，游縊精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”?！端叵颉に疅嵫ㄕ摗分[形成“其本在腎，其末在肺”的論述，體內(nèi)水液的運(yùn)行依靠肺氣的通調(diào)、脾氣的轉(zhuǎn)輸、腎氣的開闔及膀胱的氣化，因而小便通利。相關(guān)研究已證明，PI3K-AKT信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、Sphingolipid信號(hào)通路、T cell receptor等信號(hào)通路與肺、脾、腎、心生理功能及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也間接說明黃芪利水消腫功效與調(diào)節(jié)整體身體機(jī)能有關(guān)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步聚焦了黃芪的主要作用成分、可能涉及的生物學(xué)過程及作用靶點(diǎn)。通過大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)了黃芪具有利尿作用，且與黃酮類成分密切相關(guān)；但對(duì)于心衰、腎病綜合征引起的水腫，黃芪是否具有同樣的利尿效果，涉及的生物學(xué)過程及作用通路、作用靶點(diǎn)是否一致，仍需結(jié)合蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等相關(guān)研究方法進(jìn)一步明確。