賈曉寧 李家棟 邵正威 王巧云

(濱州醫(yī)學院口腔學院，山東 煙臺 264000)

芒柄花素屬異黃酮類化合物。研究證明黃芪中的黃酮類成分有增強免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突變、清除自由基等藥理作用〔1〕，而芒柄花素也可以在一定程度上降低高脂血癥金黃地鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；改善肝脂肪化、減輕炎性細胞浸潤；抑制胸主動脈壁內(nèi)膜下泡沫細胞形成和中膜平滑肌增生，具有抑制肝臟脂肪沉積和預防動脈粥樣硬化的作用〔2～4〕。芒柄花素有植物雌激素的特征，在體內(nèi)具有雌激素樣作用，可用于更年期綜合征的防治〔5〕。但芒柄花素對胃腸平滑肌運動功能的影響報道很少。本實驗通過離體家兔十二指腸平滑肌灌流方法，觀察不同濃度的芒柄花素對離體腸平滑肌收縮活動的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1藥品 芒柄花素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度為98%，批號ZL20091211)，實驗時將芒柄花素用DMSO配成藥液備用。

1.2試劑 釕紅(RR)、Bay K8644、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)購自Sigma公司；乙酰膽堿(Ach，批號091201，中科院上海生物化學研究所試劑廠)。磷酸組胺(中國科學院上海生物化學研究所)。氯化鋇(BaCl2，自貢市張家壩鹽華有限公司)。實驗用Tyrode′s 液(臺式液，g)：氯化鈉(NaCl) 8.0，氯化鈣(CaCl2) 0.2，氯化鉀(KCl) 0.2，氧化鎂(MgCl2) 0.1，NaHCO31.0，KH2PO40.05，葡萄糖1.0。無鈣Tyrode′s 液以EDTA代替CaCl2外，其余成分相同。

1.3動物 家兔 (2.5±0.4)kg，雌雄兼用(由本院動物中心提供)。

1.4儀器 BL-420F生物信號處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，JH-2型肌張力傳感器(中國北京航天醫(yī)學工程研究所產(chǎn)品)。

1.5實驗方法

1.5.1家兔離體小腸平滑肌標本的制備 取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹正中線切開腹部，取近回盲部小腸20 cm。置于盛有室溫Tyrode′s液的燒杯中，洗凈腸內(nèi)容物。將其剪成2～3 cm的腸段作為實驗標本。

1.5.2收縮活動的記錄方法 將標本的一端固定于L形鉤上，置于盛有20 ml Tyrode′s液的平滑肌槽中；另一端連接張力換能器，持續(xù)通混合氣體(0.95±0.05)CO2，每秒1～2個氣泡，溫度(37±0.5)℃ ，張力負荷2 g，平衡1 h，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，開始實驗。

1.5.3芒柄花素對小腸平滑肌自主收縮活動的影響 待回腸收縮曲線穩(wěn)定后，累計加入芒柄花素，使終濃度分別達10、20、40、60、80、100 μmol/L，加藥間隔時間為5 min，觀察芒柄花素對家兔小腸平滑肌自發(fā)收縮活動的影響。用區(qū)間測量法測量給藥前1 min及給藥后第5分鐘的張力，以給藥前的值為100%，按公式計算給藥后小腸舒張百分率〔6〕。

1.5.4芒柄花素對Ach、BaCl2及HA所致腸痙攣性收縮的影響 待回腸收縮曲線穩(wěn)定后，首先給予Ach(0.1 μmol/L)、BaCl2(10 mg/L)或組胺(HA，5 mg/L)，當刺激平滑肌收縮達平臺后，再累計加入芒柄花素(終濃度同上)，觀察其對Ach、BaCl2或HA刺激所致痙攣性收縮腸平滑肌是否具有舒張作用。

1.5.5芒柄花素對BayK8644、釕紅作用的影響 觀察芒柄花素60 μmol/L預孵育5 min后對Bay K8644(0.5 μmol/L)、釕紅(10 μmol/L)致小腸平滑肌自發(fā)收縮活動的影響。對照組采用相等容積的DMSO。

1.5.6芒柄花素對L-NAME作用的影響 待離體腸平滑肌標本收縮活動穩(wěn)定后， L-NAME(100 μmol/L) 預孵育10 min后再加入芒柄花素60 μmol/L，觀察小腸平滑肌收縮活動的變化。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件，組間差異比較采用單因素方差分析中的LSD方法。

2 結(jié) 果

2.1芒柄花素對家兔離體腸平滑肌收縮活動的影響 10～100 μmol/L芒柄花素能夠劑量依賴性抑制小腸平滑肌自發(fā)性收縮，使舒張作用增強。對HA、Ach以及BaCl2所致腸平滑肌痙攣性收縮亦均有不同程度的抑制作用，但各劑量組作用均強于腸平滑肌自發(fā)性收縮(P<0.05或P<0.01)。芒柄花素濃度為100 μmol/L時，對HA痙攣性收縮的抑制率為85.29%；BaCl2次之，抑制率為81.88%；而對Ach引起痙攣性收縮抑制率為73.16%左右，與對HA痙攣性收縮的抑制作用比較，差異有顯著性(P<0.05)；但對腸平滑肌自發(fā)收縮活動抑制作用較弱，僅為57.84%。見表1，圖1。

表1 芒柄花素對家兔離體腸平滑肌收縮活動的影響

2.2芒柄花素對Bay K8644作用的影響 Bay K8644是L型鈣離子(Ca2+)通道開放劑，與對照組比較Bay K8644(0.5 μmol/L)使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由(1.03±0.03)g增加到(1.27±0.09)g(P<0.01)；而加入芒柄花素(60 μmol/L) 后再加入Bay K8644(0.5 μmol/L)收縮張力降為(0.64±0.1)g(P<0.01，與Bay K8644組比較)。

2.3芒柄花素對RR作用的影響 RR是肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑，在臺式液中加入RR(10 μmol/L)，其抑制平滑肌細胞肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，可使小腸平滑肌自發(fā)性收縮張力減弱，RR(10 μmol/L)使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由(1.02±0.05)g減小到(0.80±0.03)g(P<0.01)；而加入芒柄花素(60 μmol/L)后再加入RR收縮張力為(0.74±0.08)g，與DMSO+釕紅組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.4芒柄花素對L-NAME作用的影響 L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，L-NAME (100 μmol/L)使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由(1.01±0.05)g變?yōu)?0.96±0.09)g，無顯著影響(P>0.05)；單加入芒柄花素(60 μmol/L)后小腸平滑肌收縮張力降為(0.68±0.14)g，與L-NAME組比較有顯著差異(P<0.01)；L-NAME+芒柄花素組使小腸平滑肌收縮張力降為(0.73±0.05)g，與芒柄花素組比較無顯著性差異(P>0.05)，說明L-NAME不能夠抑制芒柄花素舒張平滑肌的作用。

a～f:10，20，40，60，80，100 μmol/L芒柄花素

3 討 論

目前研究認為胃腸道上主要存在M膽堿受體、HA受體、5-HT受體及多種胃腸激素等受體。Ach是平滑肌內(nèi)興奮傳遞的化學物質(zhì)能，激動M膽堿受體，M受體耦聯(lián)G蛋白(GP)，使胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)濃度上升，進而引起 Ca2+釋放和底物蛋白磷酸化激發(fā)平滑肌產(chǎn)生收縮效應。HA是具有多種生理功能的胺類物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)3種HA受體，其中能被傳統(tǒng)抗組胺藥所阻滯的豚鼠平滑肌上的組胺受體被稱為H1型組胺受體(H1-R)， HA作用于H1-R使鈣通道開放，胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，促發(fā)胃腸道平滑肌收縮〔7〕。而BaCl2是通過釋放細胞內(nèi)的Ca2+而引起腸管平滑肌痙攣〔8〕。本實驗結(jié)果顯示，芒柄花素能劑量依賴性地抑制腸平滑肌的自發(fā)性收縮，為進一步觀察其收縮作用的受體機制，以Ach、HA或BaCl2引起腸平滑肌痙攣性收縮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芒柄花素對痙攣收縮的腸管平滑肌亦具有不同程度的舒張，但對痙攣收縮腸平滑肌的作用明顯強于自發(fā)性收縮腸平滑肌。

因Ach、HA以及BaCl2引起腸管平滑肌痙攣性收縮，都與腸平滑肌細胞內(nèi)Ca2+增多有關。故認為芒柄花素抑制三者引起的腸平滑肌收縮作用與降低細胞內(nèi)Ca2+濃度有關。腸道平滑肌收縮所需的大部分Ca2+是在動作電位發(fā)生時從細胞外進入肌細胞內(nèi)的，小部分來源于肌質(zhì)網(wǎng)，當胞內(nèi)Ca2+濃度升高到一定水平時，觸發(fā)平滑肌收縮〔9〕。為進一步研究芒柄花素對外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放的作用，本實驗觀察了在芒柄花素預處理下L型鈣通道(L-Ca2+)的開放劑Bay K8644以及肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑釕紅對胃腸平滑肌活動影響的變化。

腸平滑肌中主要的鈣通道是L-Ca2+，實驗中給予小腸平滑肌L型鈣通道的開放劑Bay K8644，大量的鈣離子通過L-Ca2+進入平滑肌細胞內(nèi)，使其自發(fā)收縮力提高。而給予芒柄花素后，這種效應被明顯抑制，由此可以推斷芒柄花素可能阻斷了L-Ca2+，抑制Bay K8644引起的外鈣內(nèi)流，從而抑制小腸平滑肌的收縮。肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑釕紅能夠抑制肌漿網(wǎng)釋放鈣離子，使細胞內(nèi)鈣離子濃度降低，小腸平滑肌自發(fā)收縮張力降低，而以芒柄花素預孵育后給予釕紅，其舒張腸平滑肌作用被抑制，由此推斷芒柄花素可能對肌漿網(wǎng)ryanodine受體亦發(fā)揮阻斷作用，從而抑制內(nèi)鈣釋放。

有研究表明〔10〕，NO通過激活平滑肌細胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)cGMP濃度升高，胞內(nèi)Ca2+降低，導致平滑肌舒張。本實驗中應用NO合酶抑制劑L-NAME，可以降低組織中NO的濃度，但對腸平滑肌張力無明顯影響，與文獻報道一致〔11〕。L-NAME預孵育不能抑制芒柄花素舒張腸平滑肌作用，說明芒柄花素對小腸平滑肌的抑制作用可能與NO濃度無關，但對鳥苷酸環(huán)化酶有無影響尚待進一步研究。

綜上，芒柄花素明顯抑制了家兔離體小腸平滑肌的收縮活動，抑制外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放是其機制之一，與腸平滑肌NO濃度無關。

4 參考文獻

1陳建真，呂圭源，葉 磊，等.黃芪黃酮的化學成分與藥理作用研究進展〔J〕.醫(yī)藥導報，2009；28(10):1314-6.

2孫 備.膜莢黃芪根中的抗氧化成分〔J〕.國外醫(yī)學(中醫(yī)中藥分冊)，1998；20(4):54.

3幸奠霞，劉志高，薛存寬，等.刺芒柄花素雌激素樣作用及其與血脂相關性究〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(18):2340-2.

4趙 培,楊 媛,徐 揚，等.刺芒柄花素調(diào)節(jié)血脂代謝及改善動脈粥樣硬化病變的實驗研究〔J〕.中國新藥雜志，2009；18(10):925-9.

5高 穎，胡冬華.紅車軸草異黃酮用于防治更年期綜合征的研究進展〔J〕.中國婦幼保健，2008；23(30):4359-60.

6宋士軍，李芳芳，張麗華，等.何首烏對家兔小腸平滑肌收縮活動和電活動的影響〔J〕.河北醫(yī)科大學學報，2007;28(1):85-8.

7Bolton TB，Clarkj P. Effects of histamine，high potassium and carbochol on K efflux from longitudinal muscle of guinea-pig intestine〔J〕.J Physiol,1981;20(2)：320-47.

8韓 堅,陳孝健.離體腸管實驗的研究概況〔J〕.中醫(yī)藥導報，2008；14(3):94-7.

9Bolton TB,Prestwich SA.Excitation-contraction coupling in gastrointestinal and other smooth muscles〔J〕.Annu Rev Physiol，1999；8(61)：8-115.

10周 華，宋 潔，胡金蘭，等.平滑肌細胞上的鈣庫操縱性通道〔J〕.生理科學進展，2005；36(4)：369-71.

11李 茜，馬會杰，關 玥，等.人參皂苷Rgl對家兔離體小腸平滑肌自發(fā)收縮活動的影響〔J〕.中國藥理學通報，2009；25(10)：1350-4.