唐清，朱曉梟，鄭玉瑩，關敏怡，彭維，蘇薇薇

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

補肺活血膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮的測定方法

唐清，朱曉梟，鄭玉瑩，關敏怡，彭維，蘇薇薇

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

采用HPLC構建測定補肺活血膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮的方法。以Hitachi High-Tech C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)為色譜柱，以乙腈-φ=0.2%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為260 nm，色譜柱溫度為25 ℃，流速為0.8 mL/min。經方法學驗證，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮分別在0.022 5～0.901 8 μg (R2=1)、0.007 5～0.299 0 μg (R2=1) 范圍內線性關系良好，二者的平均回收率分別為93.97% (RSD=3.46%)、90.04% (RSD=3.25%)。結果表明，所建立的方法簡單、快捷，適用于補肺活血膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮的測定。

高效液相色譜；補肺活血膠囊；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；毛蕊異黃酮；測定

中藥補肺活血膠囊具有益氣活血、補肺固腎的功效，用于肺心病(緩解期)屬氣虛血瘀證，癥見咳嗽氣促、咳喘胸悶、心悸氣短、肢冷乏力、腰膝酸軟、口唇紫紺、舌淡苔白或舌紫暗等[1]。方中黃芪為君藥，入肺脾二經，益肺健脾，補脾肺腎之氣，是補氣要藥。補肺活血膠囊中黃芪發(fā)揮藥效的物質基礎為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮，本研究建立HPLC法同時測定這兩種成分，為更好地監(jiān)控補肺活血膠囊的質量提供了依據。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品與試劑

毛蕊異黃酮(成都普菲德生物技術有限公司，151208)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(中國食品藥品檢定研究院，111920-201505)；4批補肺活血膠囊及黃芪陰性樣品均由廣東雷允上藥業(yè)有限公司提供。甲醇(天津大茂化學試劑廠，批號：20160316、20160817、20160901，分析純)、乙腈(Honeywell，批號：Q4TA1H，色譜級)；甲酸(阿拉丁，批號：D1502086，色譜級)；水為超純水。

1.2 實驗儀器

十萬分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler Toledo公司)；萬分之一電子分析天平(ME204，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(HWS24，上海一恒科技有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(SB-1200水浴鍋，N-1100)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(美國Dionex公司，DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機、WPS-3000SL自動進樣器、TCC3000-RS柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon6.8數(shù)據處理軟件)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮對照品適量，精密稱定，加φ=50%甲醇制成每1 mL含毛蕊異黃酮葡萄糖苷30 μg、毛蕊異黃酮20 μg的混合溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取補肺活血膠囊內容物，研細，取約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加φ=50%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加φ=50%甲醇至刻度，搖勻，即得補肺活血膠囊供試品溶液。

2.1.3 黃芪陰性對照溶液的制備 取黃芪陰性樣品，同2.1.2項下操作。

2.2 色譜條件

Hitachi High-Tech C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，No.27H5I-024)色譜柱：以乙腈為流動相A，以φ=0.2%甲酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫：0～25 min，16%A，84%B；25～65 min，16%～42%A，84%～58%B。檢測波長為260 nm；柱溫25 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷計算不低于13 000?；旌蠈φ掌?、黃芪陰性對照、樣品色譜圖見圖1。由圖1可知，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮的出峰位置上無其他物質的干擾。

圖1 黃芪陰性對照(A)、混合對照品(B)、補肺活血膠囊樣品(C)HPLC圖譜1：毛蕊異黃酮葡萄糖苷 ；2：毛蕊異黃酮Fig.1 HPLC chromatogram of Astragali negative control (A), mixed control (B), test samples (C)1: calycosin-7-O-glucoside ；2：calycosin

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀中，按“2.2”項下色譜條件進行分析，并對峰面積進行測定，繪制成標準曲線，以峰面積積分值A對進樣量C進行回歸分析。毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為：A1=47.456C-0.141 8(R2=1)，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.022 5～0.901 8 μg范圍內，濃度與峰面積呈良好線性關系；毛蕊異黃酮回歸方程為：A2=68.324C-0.063 8(R2=1)，表明毛蕊異黃酮在0.007 5～0.299 0 μg范圍內，濃度與峰面積呈良好線性關系。線性關系數(shù)據見表1、表2，標準曲線見圖2、圖3。

表1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性及范圍Table 1 Regression equations and liner ranges of calycosin-7-O-glucoside

表2 毛蕊異黃酮線性及范圍Table 2 Regression equations and liner ranges of calycosin

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品標準曲線Fig.2 Standard curve of calycosin-7-O-glucoside reference substance

圖3 毛蕊異黃酮對照品標準曲線Fig.3 Standard curve of calycosin reference substance

2.3.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.34%，毛蕊異黃酮峰面積的RSD為0.32%，表明該方法精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取補肺活血膠囊內容物(批號：150035)，按“2.1.2”項下方法平行制備6份補肺活血膠囊供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積。毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為2.40%；毛蕊異黃酮峰面積的RSD為2.43%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取補肺活血膠囊內容物(批號：150035)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、48 h進樣10 μL，測定峰面積，計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.29%；毛蕊異黃酮峰面積的RSD為0.30%。表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取補肺活血膠囊內容物(批號：150035)約0.6 g共9份，精密稱定，分別精密加入低、中、高濃度的對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回收率為93.87%，RSD為3.46%；毛蕊異黃酮的回收率為90.04%，RSD為3.25%。見表3、4。

2.4 樣品測定

取補肺活血膠囊樣品、，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液，按外標法計算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮的含量，結果見表5。

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率試驗結果Table 3 Recovery tests results of calycosin-7-O-glucoside

表4 毛蕊異黃酮加樣回收率試驗結果Table 4 Recovery tests results of calycosin

表5 樣品含量測定結果Table 5 Results of contents determination of samples mg·粒-1

3 討 論

依據含量測定結果，不同批次的補肺活血膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮含量的總和相差不大，但含量的比例不一樣。造成這種差異的原因：①不同產地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量具有明顯差異[2-5]；②在補肺活血膠囊生產過程中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷易受熱脫去葡萄糖轉變?yōu)槊锂慄S酮。因此，同時測定補肺活血膠囊中這兩種成分才有實際意義，這在國內尚未見有文獻報道。本研究建立了一種HPLC法同時檢測這兩種成分，具有操作簡單，重復性、加樣回收率好等優(yōu)點，為全面監(jiān)控補肺活血膠囊質量、完善其質量標準提供了科學依據。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[M].北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 1000-1001.

Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China [M]. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 1000-1001.

[2] 石子儀, 鮑忠, 姜勇, 等. 不同來源黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32 (9) : 779-783.

SHI Z Y, BAO Z, JIANG Y, et al. Quantitative analysis of calycosin glycoside and from ononetin in Radix Astragali from different sources [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2007, 32 (9) : 779-783.

[3] 姚雪蓮, 裴彩云, 王宗權. 不同產地、不同采收期黃芪藥材及飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素含量測定[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32 (5) : 797-805.

YAO X L, PEI C Y, WANG Z Q. Determination of calycosin-7-O-β-D-glucoside and formononetin in crude drugs and slices of Astragalus from different habitats and gathering periods [J]. Chin J Pharm Anal, 2012, 32 (5) : 797-805.

[4] 劉曉慶, 李軍, 薛恒躍, 等. 不同來源、不同等級黃芪飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分析[J]. 藥物分析雜志, 2013, 33 (5) : 874-880.

LIU X Q, LI J, XUE H Y, et al. Content analysis of calycosin glucoside in Astragalus slices of different sources and different grades [J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33 (5) : 874-880.

[5] 劉楊, 包華音, 王曉燕. 不同產地黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的定量分析[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐, 2014, 28 (3) : 8-10.

LIU Y, BAO H Y, WANG X Y. Determination of Calycosin-7-Glucoside in Astragali Radix from Different Place by HPLC [J]. Research and Practice on Chinese Medicines, 2014, 28 (3) : 8-10.

DeterminationofCalycosin-7-O-β-D-glucosideandCalycosininBufeihuoxueCapsulesbyHPLC

TANGQing,ZHUXiaoxiao,ZHENGYuying,GUANMinyi,PENGWei,SUWeiwei

(School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

The HPLC method was established for determination of Calycosin-7-O-β-D-glucoside and Calycosin in Bufeihuoxue Capsules. The separation was performed on Hitachi High-Tech C18(5 μm，4.6 mm×250 mm) column eluted with the mobile phase consisting of acetonitrile and 0.2% formic acid solution in gradient elution mode at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was 260 nm and the column temperature was 25 ℃. The method was validated and shown that Calycosin-7-O-β-D-glucoside and Calycosin had a good linear relationship in the range of 0.022 5～0.901 8 μg (R2=1), 0.007 5～0.299 0 μg (R2=1), respectively. The average recovery rates were 93.87% (RSD=3.46%)、90.04% ( RSD=3.25%), respectively. The established method is simple, rapid and reproducible, which is suitable for the determination of Calycosin-7-O-β-D-glucoside and Calycosin from Bufeihuoxue Capsules.

high performance liquid chromatography; Bufeihuoxue Capsule; Calycosin-7-O-β-D-glucoside; Calycosin; determination

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.06.019

2017-06-21

廣東省中醫(yī)藥局科研課題(20161050)

唐清(1993年生)，女；研究方向藥物分析；E-mail:tangq27@mail2.sysu.edu.cn

蘇薇薇(1959年生)，女；研究方向創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)、中藥上市后質量與藥效再評價技術;E-mail:lsssww@126.com

R917

A

0529-6579(2017)06-0123-05