鄒麗蓉，謝蕊，楊依然，王雪峰,2，普岳紅,2，董文明，黃艾祥

（1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，昆明 650201；2.云南省畜產(chǎn)品加工工程技術研究中心，昆明 650201）

0 引言

乳餅作為云南特色乳制品，每10 kg生鮮乳只能生產(chǎn)出1 kg乳餅，剩下的副產(chǎn)物-乳清水并沒有得到合理利用，造成大量的乳清蛋白和乳糖資源浪費[1-2]。乳清水中含有的蛋白質資源如乳鐵蛋白、乳球蛋白等，對人體免疫功能產(chǎn)生巨大影響[3-4]。乳糖也是乳清水中的主要成分，其質量分數(shù)能夠達到60%以上[5]。

近年來，國內外對乳清的開發(fā)和應用都十分重視，韓春然等[6]研究了微生物轉谷氨酰胺酶催化大豆乳清蛋白聚合的條件。Tu與李雪等[7-8]分別以大豆乳清水為原料開發(fā)大豆乳清飲料。本實驗以乳清水為原料，提取乳糖和乳清蛋白，將乳糖添加到酸奶中進行發(fā)酵，乳清蛋白通過酶解技術制備出具有一定抗氧化活性的酶解物，從而提高乳清水的綜合利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

乳清水，昆明市晉寧區(qū)乳餅加工廠；全脂奶粉，白砂糖，市售；直投式菌種，青島漢森菌業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑與設備

JJ500電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；TGL20M型高速冷凍離心機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；UFSC40001型攪拌式超濾裝置，上海摩速有限公司；NDJ-4型旋轉式黏度計，武漢格萊莫檢測設備有限公司；SVJ-358型智能商用酸奶機，北京世紀陽光有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；雷磁PHSJ-4A型pH計，上海精密科學儀器有限公司；DSX-280OKB24型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；GYB60-6S型高壓均質機，上海東華高壓均質機廠。

氯化鈣（食品級）、氯化鈉、氫氧化鈉（食品級）、磷酸氫二鈉、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉、乙酸鉛、碘、碘化鉀、甲基橙、可溶性淀粉、草酸鉀、酚酞指示劑、95%乙醇、鐵氰化鉀、磷酸二氫鉀、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、三氯乙酸、鹽酸、三氯化鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、以上試劑均購于天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳糖的提取工藝流程

乳清水→脫脂紗布過濾→加入氫氧化鈉（質量濃度400 g/L）調節(jié)pH值至7.5→按比例（12 g/L）加入氯化鈉（濃度1 moL/L)→放入水浴鍋加熱（65℃，15 min)→離心（4 000 r/min，30 min）→粗濾→微濾（0.22μm有機膜）→超濾(30 ku的PES超濾膜)→濾液冷凍干燥→乳糖凍干粉

1.2.2 乳清蛋白的提取工藝流程

參照雷靜等[9]的方法進行一定的調整。

量取1 L乳清水→加入濃度為1 mol/L的HCl（或質量濃度為400 g/L的NaOH溶液）調至pH值7.5→在60℃條件下，加入添加量為12 mL的CaCl2（濃度1 mol/L）水浴攪拌15 min→冷卻出現(xiàn)絮凝除去酪蛋白和乳脂→4℃轉速4 000 r/min離心30 min→粗濾除沉渣→采用0.22微孔膜微濾→用10 ku超濾取上清液→透析脫鹽處24 h→真空冷凍干燥→放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

1.2.3 乳清水中乳糖和乳清蛋白的提取條件優(yōu)化

1.2.3.1 乳糖提取實驗

（1）原料溫度對乳糖提取速率的影響。在料液比為1∶1，壓力為0.30 MPa，溫度梯度40、45、50、55、60℃的條件下；用30 ku的PES超濾膜提取乳糖，以膜通量為指標考察超濾過程中原料溫度對乳糖提取速率的影響。

（2）超濾壓力對乳糖提取速率的影響。在料液比為1∶1，原料溫度為55℃的條件下，壓力梯度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 MPa；用30 ku的PES超濾膜提取乳糖，以膜通量為指標考察超濾過程中超濾壓力對乳糖提取速率的影響。

（3）料液比對乳糖質量分數(shù)的影響?？刂瞥瑸V壓力為0.30 MPa、原料溫度為55℃，料液比設置為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1，用30 ku的PES超濾膜提取乳糖，以乳糖質量分數(shù)為指標考察料液比對乳糖質量分數(shù)的影響。

1.2.3.2 乳清蛋白提取實驗

（1）不同pH值對蛋白質絮凝效果的影響?？刂艭aCl2添加量為15 mL，水浴溫度為40℃，pH值設置為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，取1 L的乳清水，用HCl或NaOH調pH值，研究不同pH值對蛋白質質量分數(shù)的而影響。

（2）絮凝劑CaCl2的添加量對蛋白質絮凝效果的影響。控制pH值為7，水浴溫度為40℃濃度為1 mol/L的CaCl2的添加量設置為9、12、15、18、20 mL；取1 L的乳清水，研究CaCl2的添加量對蛋白質質量分數(shù)的影響。

（3）水浴溫度對蛋白質絮凝效果的影響?？刂苝H值為7，CaCl2溶液（濃度1 mol/L）的添加量為15 mL；水浴溫度設置為20、30、40、50、60℃；取1 L的乳清水，研究水浴溫度對蛋白質質量分數(shù)的影響。

1.2.4 乳糖提取物在酸奶中的應用

1.2.4.1 酸奶加工工藝流程

全脂奶粉→調配（溫水調配）→復原乳→添加白砂糖（質量分數(shù)8%）→均質（8～10 MPa）→滅菌(巴氏殺菌85℃,15 min)→冷卻（30～45℃）→接種（接種量0.2%）→發(fā)酵（43℃）→冷藏后熟（2～4℃）

1.2.4.2 酸奶發(fā)酵實驗

用乳糖提取物凍干粉代替質量分數(shù)為50%蔗糖，按照1.2.4.1酸奶加工工藝進行酸奶制作，并進行感官評價和相關理化指標測定。

1.2.5 乳清蛋白提取物的酶解實驗

稱取一定量的乳清蛋白提取物凍干粉，按一定的質量比（1∶30）加入去離子水于燒杯中溶解乳清蛋白，混合均勻后分別添加4%的4種蛋白酶在各自的最適溫度、pH值條件下（見表1）酶解5 h（每0.5 h測一次pH值，保持pH值不變）。待酶解結束后立刻置于95℃滅酶10 min,在4℃轉速為4 000 r/min離心30 min,過濾收集上清液,放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆肹10-11]。

表1 不同的蛋白酶最適條件

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 乳糖質量分數(shù)測定

參照伍桃英等[12]方法，采用碘量法測定乳糖質量分數(shù)。

樣品的預處理：準確稱取(1±0.0001)g乳糖粉溶解、定容至250 mL,加人4 mL草酸鉀一磷酸氫二鈉溶液和4 mL質量分數(shù)20%的乙酸鉛、搖勻后靜置，用濾紙過濾,初濾液舍棄,續(xù)濾液備用。

樣品測定:移取濾液25.00 mL于碘量瓶中，分別加入1滴0.1%甲基橙、7.50 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH和25.00 mL濃度為0.1 mol/L碘液，搖勻后加塞液封置暗反應30 min，加人8.00 mL濃度為0.5 mol/L的HCl搖勻，用標準Na2S2O3溶液滴定，變黃后滴加3滴1.0%的淀粉指示劑，搖勻繼續(xù)滴定至淡粉色，靜置30 s不變色，記錄消耗Na2S2O3的體積,同時做平行與空白。

乳糖質量分數(shù)計算[12]：

式中：V空為滴定空白消耗Na2S2O3的體積（mL)；V樣為滴定樣品消耗Na2S2O3的體積（mL)；C樣為Na2S2O3的濃度（mol/L)；m樣為樣品質量（g)；V濾液為移取樣品濾液的體積（25 mL）；V總為總體積（250 mL)；0.18為乳糖換算系數(shù)。

1.2.6.2 蛋白質質量分數(shù)的測定

參照國標GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法，測定蛋白質質量分數(shù)。

1.2.6.3 酸奶理化指標的測定

酸度（°T）測定參照GB 5009.239-2016；黏度的測定：將酸奶裝在直徑大于70 mm的玻璃燒杯中，保持酸奶溫度在室溫范圍內，用旋轉黏度計4號轉子測定，轉速為30 r/min經(jīng)過多次旋轉，20～30 s進行讀數(shù)，測量3次取平均值；pH值測定：pH計直接測定；持水率的測定：參照Hassan[13]的方法，取15～20 g樣品，10℃下轉速為13 500 r/min離心30 min,過濾后稱沉淀物的質量，所得持水率=離心沉淀物質量/樣品質量×100%；感官評定：參考GB 19302-2010，邀請10人對兩種酸奶進行感官評分計算平均值。

1.2.6.4 乳清蛋白酶解物水解度的測定

在96孔酶標板中分別加入4種酶解液2.5μL和OPA混合液100μL，然后在340 nm的波長下25℃反應8 min后測酶解液的吸光度。求出各個酶解液中肽的質量分數(shù)。用pH值為7.0濃度為1.0 mmol/L的PBS配制質量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的GSH作為標準繪制多肽質量分數(shù)的標準曲線[14-15]。水解度為[14]

1.2.6.5 乳清蛋白酶解物DPPH清除能力的測定

DPPH自由基清除能力測定是參照文獻的方法[16]。準備濃度為0.2 mol/L的DPPH溶液和體積分數(shù)為70%的乙醇溶液待用。分別在96孔板上加入1 mL的DPPH與1 mL樣品溶液混合均勻避光反應30 min（室溫下），記為A1；將1 mL體積分數(shù)為70%乙醇溶液與1 mL樣品溶液反應液混合均勻作為對照組，記為A2；以1 mL的DPPH與1 mL體積分數(shù)為70%乙醇溶液作為空白組，記為A0。測定分析在517 nm波長下不同樣品液的吸光值。按式（2）計算DPPH自由基清除率，即[16]

式中：A0為空白組樣品的吸光值；A1為實驗組樣品的吸光值；A2為對照組樣品的吸光值。

1.2.6.6 乳清蛋白酶解物還原能力測定

取1 000μL各個酶解液中，再分別加入2 500μL鐵氰化鉀溶液（質量分數(shù)為1%）和2 500μL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液（濃度為0.2 mol/L），混合均勻后保溫20 min（50℃水浴條件下），加入三氯乙酸（質量分數(shù)為10%）2 500μL，混合均勻后在3 000 r/min的 轉速下離心10 min，取上清液2 500μL，隨后加入2 500μL蒸餾水和2 500μL三氯化鐵（質量分數(shù)為0.1%）混勻，從每個樣品液中取出200μL分別加入到96孔板中，于700 nm檢測波長下溶液反應10 min后測定其吸光值，記為A1;以緩沖液替代樣品液作為空白對照，記為A0[17]。

所有樣品進行3組平行重復，結果表示為平均值±標準偏差，用SPSS11.5軟件進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乳糖的提取實驗

由圖1（a）可以看出，膜通量隨著超濾壓力的增加而增加，當壓力到達0.35 MPa后，膜通量逐漸減小。原因是在超濾過程中產(chǎn)生了濃差極化和膜壓實，使膜表面形成凝膠層，增大了物料通透阻力，增厚的凝膠層與壓力作用部分抵消使得膜通量減小[3]。因此本實驗中0.35 MPa為乳糖超濾的最適壓力。由圖1（b）可知，原料溫度越高膜通量也越大，其原因是溫度升高，乳清水黏度降低，超濾膜表面孔隙擴大，膜通量也越來越大。隨之時間推移，原料溫度逐漸下降，乳清水逐漸變黏，膜通量也隨之下降。在60 min左右各溫度下的膜通量差距不大，為了合理利用其中的乳清蛋白，防止溫度過高使乳清蛋白變性和微生物增長、提高乳糖提取速率[18]，本研究選取55℃為超濾原料初始溫度。由1（c）可以看出，當料液比為1∶3(體積比)的時，獲得的乳糖質量分數(shù)最大，隨著料液比的減小，乳糖的質量分數(shù)減少，其主要原因是因為超濾不充分，部分乳糖還存在于上清液中。但料液比在1∶2（體積比）和1∶3(體積比)條件下，提取的乳糖量差異不大，為減少耗能，節(jié)省工藝時間，本實驗控制料液比為1∶2，測得乳糖質量分數(shù)為68.22%。

2.2 乳清蛋白的提取

隨著溫度的升高，溶液形成的絮凝容易沉淀。由于乳清蛋白在熱和酸的作用下極易變性，屬于一種敏感性的蛋白質。由圖2（a）可以看出，溫度為20～60℃的蛋白質質量分數(shù)波動比較大，因此溫度的變化對蛋白質質量分數(shù)的影響比較大，也局限了乳清蛋白的加工方式。由圖2（b）得出，pH值在6.5～7.5的環(huán)境中出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象較為明顯，這是因為pH值的變化伴隨著乳清中的Ca2+的變化；而當pH值為8時，堿性條件下絮凝減少，同時隨著乳清水pH值的上升，乳清蛋白變性加劇，使得蛋白質質量分數(shù)降低。由于CaCl2的添加導致乳清水中的磷酸和磷酸鹽發(fā)生絮凝或沉淀。由圖2（c）可以看出，當1 L乳清水中濃度為1 mol/L的CaCl2的添加量達到18 mL時，蛋白質質量分數(shù)下降快，蛋白質發(fā)生變性。而當添加量在12～18 mL時，蛋白質質量分數(shù)變化不大。因此，1 L乳清水中CaCl2添加量應控制在12～18 mL范圍內比較合適。

由圖2可以看出，pH值在6.5～7.5；CaCl2的添加量在12～18 mL；溫度處在40～60℃的范圍內，確定pH值為7.5、CaCl2的添加量為12 mL和水浴溫度為60℃作為最優(yōu)條件，乳清蛋白質量分數(shù)達到39%。

圖1 不同單因素對乳糖質量分數(shù)的影響

圖2 不同單因素對蛋白質絮凝效果的影響

2.3 酸奶相關理化指標

2.3.1 酸奶感官評價

對普通酸奶和添加乳糖粉的酸奶進行感官評分，評分結果平均值如圖3所示。由圖3可以看出，添加乳糖凍干粉的酸奶與普通酸奶相比，其酸甜比以及黏稠度出現(xiàn)明顯提高，奶香味和組織狀態(tài)略微提升，酸奶風味出現(xiàn)略微下降。說明乳糖粉的添加對酸奶發(fā)酵有一定的影響，且能夠改善發(fā)酵乳的品質特性，提高酸奶的感官評分。

圖3 酸奶感官評分

2.3.2 酸奶相關理化指標

使用提取的乳糖提取物凍干粉所發(fā)酵制成的酸奶與普通酸奶的理化指標如表2所示。由表2可以看出，經(jīng)過相同的發(fā)酵工藝過程，添加乳糖提取物凍干粉的酸奶pH值為4.25、酸度為101°T，比普通酸奶略高；添加乳糖凍干粉的酸奶比普通酸奶黏度增加了2 400 mPa·s；添加乳糖提取物凍干粉的酸奶的持水率為79.4%，比普通酸奶高13.2%，說明乳糖的添加對酸奶的品質有一定影響。

表2 普通酸奶與添加乳糖凍干粉酸奶的理化指標測定

2.4 乳清蛋白酶解效果

將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶4種酶分別在最適的pH和溫度下對乳清蛋白進行酶解。由圖4中水解度和圖5 DPPH清除能力、總還原能力的綜合比較，胃蛋白酶作為本實驗的酶得到的DPPH和水解度最高，因此胃蛋白酶是最佳選擇。胃蛋白酶是一種消化酶，進行水解可以緩解人體內對酶解產(chǎn)物的影響[19]。4種水解酶中胃蛋白酶酶解乳清蛋白后水解度為24%，DPPH清除能力64%，還原能力0.25。

圖4 不同蛋白酶酶解物水解度比較

圖5 不同蛋白酶酶解物抗氧化能力比較

3 結論

本實驗以乳餅加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物—乳清水為原料，通過微濾、超濾等技術對乳清水中的乳糖、乳清蛋白分別進行提取，乳糖提取物中乳糖質量分數(shù)為68.22%，乳清蛋白提取物中蛋白質質量分數(shù)為39%。所得乳糖提取物加工形成的酸奶，獲得的發(fā)酵乳pH為4.25、酸度為101°T，黏度為7 800 mPa·s、持水率為79.4%、感官評分為88，組織狀態(tài)良好、呈乳白色、具有發(fā)酵乳特有香味且酸甜適口。將乳清水中的另一提取物乳清蛋白進行質量分數(shù)的測定，最終測定蛋白質的質量分數(shù)為39%，用胃蛋白酶酶解乳清蛋白粉得到的蛋白酶解物抗氧化活性較高，并對其抗氧化能力進行測定，其水解度為24%、DPPH清除能力64%、還原能力0.25。該研究為乳糖、乳清蛋白的提取利用提供參考，進一步提升了乳餅加工副產(chǎn)物的綜合利用率。