林智偉，常甜甜，周英

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237）

0 引言

在乳制品的生產(chǎn)和加工中，超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）等超高溫設(shè)備及管壁不可避免地殘留部分乳制品。殘留的乳制品以蛋白質(zhì)、脂肪、無(wú)機(jī)鹽和糖類(lèi)等成分在設(shè)備上沉積結(jié)垢[1]。乳制品是微生物的良好養(yǎng)分，結(jié)垢污染物將導(dǎo)致細(xì)菌沉積并成為微生物滋生地[2]，影響牛奶及其他乳制品的質(zhì)量安全[3]。為避免食物性疾病發(fā)生[4]，乳制品生產(chǎn)設(shè)備的衛(wèi)生情況尤其重要。

傳統(tǒng)的乳制品污垢清洗工藝選擇常規(guī)的化學(xué)原料作為主要清潔成分。酸堿清洗劑的價(jià)格低廉且操作簡(jiǎn)便，但存在許多缺陷[5]。燒堿使用不當(dāng)會(huì)灼傷操作人員，與水溶液里的Ca2+、Mg2+容易產(chǎn)生沉淀，在管道內(nèi)形成水垢增加清洗難度，并且會(huì)腐蝕設(shè)備中的橡膠類(lèi)零件，減少使用壽命[6]。磷酸和硝酸使用頻率較高、清洗效果較好，但易殘留，加熱條件下的PO43-破壞牛乳的鈣鹽平衡產(chǎn)生白色沉淀。硝酸易揮發(fā)形成腐蝕性酸霧。次氯酸鈉等氯化物具有良好的殺菌和消毒效果，但次氯酸鈉中的Cl-會(huì)點(diǎn)蝕不銹鋼設(shè)備，長(zhǎng)時(shí)間使用甚至發(fā)生管道穿孔。如今的洗滌劑行業(yè)面臨清洗排放后的工業(yè)用水變成破壞環(huán)境的高酸堿度廢水及傳統(tǒng)單一成分的清潔劑不能達(dá)到祛污需求等問(wèn)題[7]。而在清潔劑中加入酶制劑等新工藝的發(fā)展，極大改善了清潔劑的除污力和清潔效能[8]。生物酶具有高效催化率，添加到清洗劑中可以增強(qiáng)不同污跡的祛污性[9]，還能提高環(huán)境安全性[10]。如今微生物產(chǎn)酶已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，大量的研究也改善了酶制劑的耐堿、耐熱性能，加酶洗滌劑的安全性也得到證明。

本研究在酪蛋白和乳清蛋白（WPC）模型流體的基礎(chǔ)上[11-17]，加入模擬牛奶濾液（SMUF）[18]制備模擬奶垢代替超高溫設(shè)備管道中的奶垢，解決工廠管道奶垢性質(zhì)不穩(wěn)定，不同生產(chǎn)批次成分差異明顯的問(wèn)題。通過(guò)酶制劑和堿性鹽及NaOH溶液進(jìn)行不同方式的復(fù)配，使用紫外光譜監(jiān)測(cè)奶垢中蛋白質(zhì)的降解效果[16]。探究在適宜的條件下，用可生物降解的酶制劑替代部分酸堿洗滌劑是有效且經(jīng)濟(jì)可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、酪蛋白、酪氨酸、四硼酸鈉、碳酸鉀、磷酸氫二鈉購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司；三氯乙酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀購(gòu)自永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；一水檸檬酸甲購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；二水檸檬酸鈉、硫酸鉀、氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、乳糖購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；二水氯化鈣購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；六水氯化鎂購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；食品級(jí)酪蛋白、乳清蛋白購(gòu)自河南譽(yù)州生物科技有限公司；氫氧化鈉溶液購(gòu)自上海柯靈展新化工有限公司；堿性蛋白酶、脂肪酶、糖化酶，市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FiveEasy Plus臺(tái)式pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)；HH-WO油浴鍋，河南予華；Synergy Mx酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System；ZQLY-180N振蕩器，上海知楚；RR400Q101超純水制備系統(tǒng)，默克（上海）。

1.2 方法

1.2.1 模擬奶垢的制備

超濾液（SMUF）的配制調(diào)整如下:11.61 mmol/L KH2PO4、3.70 mmol/L K3C6H5O7·H2O、6.09 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O、1.03 mmol/L K2SO4、2.17 mmol/L K2CO3、8.05 mmol/L KCl、8.98 mmol/L CaCl2·2H2O、3.21 mmol/L MgCl2·6H2O、24.0 g乳糖攪拌溶解并定容至480 mL。按照表1制備不同蛋白比例的模擬奶垢,置油浴鍋中于130℃加熱2 h，冷卻至室溫后于4℃冰箱保存使用。

表1 制備模擬奶垢配料表

1.2.2 模擬奶垢的質(zhì)構(gòu)測(cè)定

奶垢切成重量和形狀相近的長(zhǎng)方體。質(zhì)構(gòu)儀的檢測(cè)前后速度為1 mm/s，壓縮程度為25%，探頭選擇P36。

1.2.3 堿性蛋白酶的活力測(cè)定

參照GB/T 23527-2009法，調(diào)整反應(yīng)體積且將酶標(biāo)儀作為檢測(cè)儀器。酪蛋白溶液使用前在40℃水浴鍋中預(yù)熱5 min。分別取1.0 mL酶液在適宜溫度中預(yù)熱2 min，空白組加入2.0 mL三氯乙酸，實(shí)驗(yàn)組加入1.0 mL酪蛋白溶液。搖勻且在40℃水浴鍋中反應(yīng)10 min后，空白組加入1.0 mL酪蛋白溶液，實(shí)驗(yàn)組加入2.0 mL三氯乙酸，充分搖勻后靜置5 min，過(guò)濾。分別取1 mL濾液在275 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.2.4 模擬奶垢降解的測(cè)定

采用紫外光譜275 nm（蛋白質(zhì)常用光譜250～320 nm范圍內(nèi)的吸光度測(cè)量可準(zhǔn)確方便地測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)濃度）和細(xì)菌濃度600 nm分別表示溶液中被降解的蛋白質(zhì)濃度和上清液渾濁度。設(shè)NaOH溶液的降解效果為100%。

1.2.5 酶制劑與NaOH溶液的測(cè)定

根據(jù)工廠的管道清潔環(huán)境和實(shí)際情況[19-20]，設(shè)置溫度60℃，轉(zhuǎn)速75 r/min，時(shí)間40～60 min的恒溫?fù)u床模擬管道清洗條件。NaOH溶液的濃度均為1.5%[21]。

（1）堿性蛋白酶與NaOH溶液混合降解。對(duì)照組為NaOH溶液，實(shí)驗(yàn)組為NaOH溶液和堿性蛋白酶AKP-2不同方式的混合復(fù)配。堿性蛋白酶溶液酶活單位為200 U/mL。

（2）不同種類(lèi)的酶制劑與NaOH溶液混合降解。對(duì)照組為NaOH溶液，實(shí)驗(yàn)組為NaOH溶液和多種酶制劑以不同比例的混合復(fù)配。酶制劑溶液酶活單位為200 U/mL。

（3）堿性蛋白酶與堿性鹽溶液混合降解。對(duì)照組為NaOH溶液，實(shí)驗(yàn)組分別為加入NaOH調(diào)整pH至10.5（堿性蛋白酶酶活最適pH）的NaHCO3和堿性蛋白酶AKP-2混合溶液以及Na2CO3和堿性蛋白酶AKP-2混合溶液。堿性蛋白酶溶液酶活單位為100 U/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬奶垢的外觀和質(zhì)構(gòu)分析

如圖1所示，根據(jù)市售奶制品常見(jiàn)的3種蛋白比例制備的模擬奶垢，外觀顏色無(wú)明顯差異，主要呈現(xiàn)黃褐色海綿狀，與乳品廠中超過(guò)110℃形成的灰黃色奶垢外觀相近。這兩種蛋白性質(zhì)不同，酪蛋白可支撐結(jié)構(gòu)；乳清蛋白熱穩(wěn)定差，易受高溫影響，因此酪蛋白和乳清蛋白影響奶垢的硬度和黏性[22-23]。

圖1 不同蛋白比例的奶垢外觀

由表2可知，酪蛋白比例越大，模擬奶垢硬度越大。其中兩種蛋白比例為8∶2制備的奶垢的硬度最大。UHT等超高溫乳制品生產(chǎn)加工設(shè)備產(chǎn)生的奶垢比實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中制備的模擬奶垢所需條件更加復(fù)雜，以硬度指標(biāo)作為首要考慮因素，后續(xù)采取酪蛋白和乳清蛋白為8∶2的比例制備模擬奶垢。

表2 不同蛋白比例奶垢的質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果

2.2 堿性蛋白酶的篩選

不同蛋白酶的酶活通常測(cè)定條件不同，需要在相同條件下篩選出酶活性高，熱穩(wěn)定性好的堿性蛋白酶。如圖2所示，4種堿性蛋白酶在60℃的酶活測(cè)定，前3種酶制劑的活性較高，均超過(guò)1.8×105U/g，屬于耐高溫高堿酶制劑，AKP-4的酶活性低于5.0×103U/g。如圖3所示，堿性蛋白酶AKP-1、AKP-2、AKP-3在60℃，40 min內(nèi)分別保留了83%、95%和93%的殘留活性。

圖2 堿性蛋白酶的酶活

圖3 堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性

2.3 酶制劑與NaOH溶液的復(fù)配降解

商用清潔劑常含有表面活性劑、助劑及酶制劑等成分[24]。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為酶制劑和NaOH溶液共同作用，可將乳制品污染的膜恢復(fù)其滲透性[25]。

2.3.1 堿性蛋白酶和NaOH溶液混合降解

圖4和圖5顯示堿性蛋白酶AKP-2和NaOH溶液混合復(fù)配降解奶垢的效果。最高降解率可達(dá)到NaOH溶液降解效果的93%（OD275）和95%（OD600）。NaOH溶液?jiǎn)为?dú)作用越久，奶垢的降解效果越好。堿性蛋白酶和NaOH溶液混合，導(dǎo)致蛋白酶在堿性環(huán)境中變性失活，部分NaOH溶液無(wú)法參與降解過(guò)程。一旦混合越久，不恰當(dāng)?shù)膹?fù)配方式將弱化NaOH溶液和堿性蛋白酶的共同作用。雖然合理的復(fù)配方式可以降解奶垢，但部分復(fù)配方式中蛋白酶的活性受到NaOH溶液影響，降低了酶的利用率。

圖4 降解模擬奶垢的效率OD275

圖5 降解模擬奶垢的效率OD600

2.3.2 不同種類(lèi)的酶制劑與NaOH溶液混合降解

由圖6和圖7可知，不同復(fù)配方式均達(dá)到不同的降解效果。最高降解率可達(dá)到NaOH溶液降解效果的92%（OD275）和93%（OD600）。模擬奶垢的主要成分是酪蛋白和乳清蛋白，堿性蛋白酶在蛋白降解中起到重要作用。但是酶制劑本質(zhì)屬于蛋白，蛋白酶抑制其它酶制劑的活性，降低利用效率。未來(lái)考慮改變蛋白酶在洗滌劑中的情況，可為復(fù)合洗滌劑的開(kāi)發(fā)提供更多思路。

圖6 降解模擬奶垢的效率OD275

圖7 降解模擬奶垢的效率OD600

2.3.3 堿性蛋白酶和堿性鹽混合降解

Na2CO3和NaHCO3對(duì)環(huán)境污染少且腐蝕性弱。NaHCO3溶液常用于清洗醫(yī)療器械中的脂肪蛋白等混合污垢，含水Na2CO3溶液在高溫下能清洗油污。添加Na2CO3和NaHCO3溶液可減少NaOH溶液使用量，從而提高堿性蛋白酶的利用率。

結(jié)果如圖8和圖9所示，NaHCO3和堿性蛋白酶AKP-2的復(fù)配降解效果僅達(dá)到NaOH溶液降解效果的59%（OD275）和65%（OD600），平均降解率為62%。NaHCO3通過(guò)軟化奶垢，減少其與設(shè)備的附著達(dá)到清洗效果，而NaOH溶液直接將奶垢中的蛋白質(zhì)分子分解成小分子。在工廠設(shè)備中，奶垢與設(shè)備的黏著性越低越容易被清洗，雖然降解效果有待提高，但作為堿性助劑的NaHCO3溶液，在奶垢清洗劑的開(kāi)發(fā)中十分具有前景。

圖8 降解模擬奶垢的效率OD275

圖9 降解模擬奶垢的效率OD600

Na2CO3洗劑常用于清除油脂和礦物鹽等。硬水中的礦物鹽和雜質(zhì)在壁上形成難溶解物質(zhì)而產(chǎn)生水垢，通過(guò)Na2CO3可以去除。Na2CO3和油脂反應(yīng)后生成可溶于水的脂肪酸鹽。結(jié)果如圖10和圖11所示，Na2CO3和堿性蛋白酶AKP-2的復(fù)配降解效果達(dá)到純NaOH降解效果的69%（OD275）和79%（OD600），平均降解率為74%。CO32-比HCO3-更易水解，堿性更強(qiáng)，所以降解效果更好。

圖10 降解模擬奶垢的效率OD275

圖11 降解模擬奶垢的效率OD600

3 結(jié)論

研究結(jié)果證實(shí)，堿性蛋白酶等酶制劑和NaOH溶液復(fù)配可降解奶垢。通過(guò)添加堿性鹽NaHCO3和Na2CO3代替NaOH，與堿性蛋白酶混合復(fù)配降解奶垢。雖然目前該替代方案的降解效果未達(dá)到NaOH溶液的降解效果，但堿性鹽腐蝕少污染小的特性十分具有前景，為代替部分NaOH用量提供了可能。

但是在堿性蛋白酶和NaOH復(fù)配以及不同酶制劑復(fù)配中，部分方案的蛋白酶容易受到NaOH影響或者其余酶制劑活性受到蛋白酶影響。為提高降解效率，合理正確的復(fù)配工藝正成為未來(lái)研究方向。