曹珺,劉絨梅,羅力文,孫金威,吳華星,呂雪鵬,高達(dá),李啟明,3

(1.乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，成都 610000；2.新希望乳業(yè)股份有限公司，成都 610000；3.四川省優(yōu)質(zhì)乳品制備與質(zhì)量控制技術(shù)工程實驗室,成都 610000）

0 引言

益生菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，在腸道微生態(tài)平衡的調(diào)控及某些疾病的防治中發(fā)揮重要作用[1-6]，然而胃酸和腸道膽汁鹽、消化酶等體內(nèi)環(huán)境會致其死亡。鼠李糖乳桿菌grx10是一株具有降血脂功能的益生菌，已在發(fā)酵乳中進(jìn)行應(yīng)用轉(zhuǎn)化[7-9]，但其較強的產(chǎn)酸能力限制了適用產(chǎn)品范圍[10]。包埋技術(shù)利用高分子材料將物質(zhì)包裹在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中從而減少內(nèi)外物質(zhì)接觸，包埋益生菌可以緩解其對外界的影響及惡劣外環(huán)境對其造成損害[11-13]。

本研究通過體外模擬實驗比較分析了鼠李糖乳桿菌grx10與同樣產(chǎn)酸能力較強的副干酪乳桿菌Lpc37[15]在被包埋前后對胃腸道環(huán)境的耐受性，考察了含益生菌晶球的酸奶在貨架期內(nèi)pH、酸度和活菌數(shù)的變化及末期感官測評，為益生菌包埋技術(shù)在酸奶領(lǐng)域的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）grx10，來自新希望乳業(yè)股份有限公司；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）Lpc37購自丹尼斯克（中國）有限公司。分別包埋grx10和Lpc37的益生菌晶球及實驗中所用酸奶均由新希望乳業(yè)股份有限公司提供。

1.1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基、牛膽鹽，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥1∶3 000），德國BioFroxx；胰蛋白酶（≥50 000 U/g，1∶250，BR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；0.22μm水系針式過濾器，上海新亞凈化器件廠。檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀，均為分析純。

用PBS緩沖液配制模擬膽鹽溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的牛膽鹽），按照2020《中國藥典》第四版配制人工胃液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的胃蛋白酶）、人工腸液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的胰蛋白酶，pH值為6.8）[15]。蛋白酶用0.22μm水系針式過濾器過濾除菌，其余試劑均121℃（15 min）滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

BBS-DDC醫(yī)用潔凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；INC821C兩槽式恒溫培養(yǎng)箱，雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司；UPT-I-10T超純水機，成都超純科技有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MLS-3020高壓滅菌鍋，松下電器（中國）有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TA.XTplus物性測試儀，超技儀器有限公司；FiveEasy Plus pH計、T5電位滴定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 晶球大小、質(zhì)構(gòu)及含水率測定

大小：每種晶球隨機取10～15顆，用游標(biāo)卡尺測量其直徑，求平均值。

硬度：將單顆晶球放置在質(zhì)構(gòu)儀測試臺中央，使用A/BE探頭，直徑=35 mm，探頭移動速率=1.00 mm/s，觸發(fā)力=5.0 g，隨機測定10～15顆晶球硬度，求平均值。

含水率：取一定量的晶球置于105℃烘箱烘至恒重并記錄。含水率計算公式為：

式中：M1為烘干前質(zhì)量；M2為烘干后質(zhì)量。

1.3.2 活菌數(shù)測定

益生菌晶球：取一定量晶球，先用濃度為60 mmol/L檸檬酸鈉溶液[16]溶解，再參照《GB4789.35-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》檢測活菌數(shù)。

益生菌粉：參照《GB4789.35-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》檢測活菌數(shù)。

1.3.3 存活率比值

通過比較益生菌晶球和益生菌粉經(jīng)模擬消化后的存活率比值研究包埋處理對菌株抵御胃腸道環(huán)境效果的影響。存活率比值計算公式為：

式中：A1為益生菌晶球經(jīng)消化后活菌數(shù)；A0為益生菌晶球初始活菌數(shù)；B1為益生菌粉經(jīng)消化后活菌數(shù)；B0為益生菌粉初始活菌數(shù)。

1.3.4 模擬胃液消化

人體胃液pH值通常在3.0左右，空腹時在2.0左右[17]，消化時間通常為2～3 h[18-19]。本研究選擇2.0、2.5和3.0 3個pH值以及1.0、2.0、3.0 h 3個時間點進(jìn)行模擬胃液實驗驗證益生菌耐酸性。

益生菌晶球：將益生菌晶球置于10 mL注射器中，模擬口腔咀嚼進(jìn)行擠壓破碎，然后分別稱取1.0 g晶球碎塊加到pH值為2.0、2.5、3.0的19 mL人工胃液中進(jìn)行模擬消化處理，分別消化1.0、2.0、3.0 h后，濾掉消化液并用生理鹽水清洗晶球表面1次，按照

1.3.2 方法測定活菌數(shù)，每組3個平行。

益生菌粉：將益生菌凍干粉溶于生理鹽水，制成與晶球中的益生菌具有相同數(shù)量級的菌粉溶液。分別取1.0 g菌粉溶液加到pH值為2.0、2.5、3.0的19 mL人工胃液中進(jìn)行模擬消化處理，分別消化1.0、2.0、3.0 h后，測定活菌數(shù)，每組3個平行。

1.3.5 模擬膽汁與腸液消化

食物在小腸內(nèi)停留時間比在胃中長，約3～8 h[20]。食物過胃后進(jìn)入十二指腸，膽汁和胰液在此被注入，小腸內(nèi)膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%左右[21]。本研究分別探索益生菌在模擬膽鹽和人工腸液中的存活情況。分別用模擬膽鹽溶液和人工腸液，取1.5、3.0、4.5 h 3個時間點，按照1.3.4對益生菌晶球和益生菌粉進(jìn)行消化實驗。

1.3.6 益生菌晶球酸奶貨架期性質(zhì)跟蹤

以市售新希望某原味酸奶作為對照，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的益生菌晶球至原味酸奶中制成益生菌晶球酸奶，分別監(jiān)測對照組酸奶與益生菌晶球酸奶21 d貨架期內(nèi)pH、酸度、活菌數(shù)及末期的感官性質(zhì)。由新希望乳業(yè)股份有限公司科技研究院感官品評團隊和消費者共100人參與感官測評，測評標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)

(續(xù)表1)

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖；以SPSS Statistics 20進(jìn)行方差分析（ANOVA），顯著水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃腸道環(huán)境中晶球?qū)σ嫔谋Ｗo效果

2.1.1 晶球大小、質(zhì)構(gòu)及含水量

將包埋了益生菌的非干燥透明球稱為“益生菌晶球”，晶球的主要成分為一種或多種具有離子凝膠性質(zhì)的食品膠體[22]，圖1為益生菌晶球示意圖。

圖1 益生菌晶球示意圖

分別包埋鼠李糖乳桿菌grx10，副干酪乳桿菌Lpc37的兩種益生菌晶球的直徑、硬度、含水量測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，實驗所用兩種益生菌晶球的基本性質(zhì)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 包埋不同益生菌的晶球的基本性質(zhì)

2.1.2 對人工胃液的耐受性

益生菌需通過胃酸屏障以活菌形式到達(dá)腸道來發(fā)揮作用，因此本研究的益生菌晶球應(yīng)在人工胃液中不溶解、不破碎，保證順利到達(dá)腸道釋放包埋益生菌。分別包埋grx10和Lpc37的晶球與對應(yīng)菌粉在不同pH值的人工胃液中消化1.0、2.0、3.0 h后的活菌數(shù)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH值的人工胃液對益生菌晶球和菌粉活菌數(shù)的影響

grx10和Lpc37的晶球和菌粉經(jīng)pH值為2.0的人工胃液消化1.0 h后活菌數(shù)均小于10 g-1（圖中未展示）。由圖2可知，經(jīng)pH值為2.5的人工胃液消化2.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌數(shù)分別提高了3.5和5.8個數(shù)量級，存活率分別是3 167和696 398倍（P＜0.05）；消化3.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌數(shù)分別提高了4.4和5.2個數(shù)量級，存活率分別是27 959和152 432倍（P＜0.05）。經(jīng)pH值為3.0的人工胃液消化2.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌數(shù)分別提高了1.5和3.2個數(shù)量級，存活率分別是34和1466倍（P＜0.05）；消化3.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌數(shù)分別提高了1.6和3.6個數(shù)量級，存活率分別是39和3 877倍（P＜0.05）。可見，晶球包埋能顯著提升益生菌grx10和Lpc37對人工胃液的耐受性，提升效果與被包埋菌株種類有關(guān)，由圖可知grx10耐酸能力優(yōu)于LPC37，包埋對耐酸能力較弱益生菌的提升更顯著。另外各組中益生菌晶球在人工胃液消化中僅變軟不溶解，可順利到達(dá)腸道進(jìn)行釋放。

2.1.3 對膽鹽的耐受性

食物過胃后進(jìn)入十二指腸與具有抑菌作用的膽鹽接觸，膽鹽會破壞細(xì)胞膜造成細(xì)胞死亡，因此需要評估益生菌對高濃度膽鹽的耐受能力[23]。分別含grx10，Lpc37的晶球和菌粉在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%膽鹽溶液中消化1.5，3.0，4.5 h后的活菌數(shù)如圖3所示。

圖3 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的膽鹽對益生菌晶球和菌粉活菌數(shù)的影響

由圖3可知，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的膽鹽溶液消化3.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌數(shù)分別提高了3.9和1.1個數(shù)量級，存活率分別是7 229和13倍（P＜0.05）；消化4.5 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌數(shù)分別提高了4.2和1.7個數(shù)量級，存活率分別是16 347和52倍（P＜0.05）。表明晶球包埋使grx10和Lpc37對膽鹽的耐受性得到顯著提升。同樣，晶球包埋對益生菌膽鹽耐受能力的提升效果因被包埋菌株種類而不同，對耐膽鹽能力較弱益生菌的提升更顯著。

2.1.4 對人工腸液的耐受性

分別含grx10和Lpc37的晶球和菌粉在人工腸液中消化時間分別為1.5，3.0，4.5 h后的活菌數(shù)如圖4所示。

由圖4可知，經(jīng)4.5 h人工腸液消化后，晶球和菌粉中g(shù)rx10和Lpc37的活菌數(shù)均保持在108g-1范圍，grx10和Lpc37晶球中菌株存活率相比菌粉分別為1.45和1.80倍，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）?？梢?，grx10和Lpc37菌株本身對人工腸液具有良好的耐受性，經(jīng)晶球包埋后仍能維持其在腸液中的活菌數(shù)。

腸溶性結(jié)果表明，益生菌晶球在人工腸液中持續(xù)震蕩處理3.0 h可完全溶解，且在前述人工胃液和模擬膽汁鹽溶液中晶球僅會變軟不會溶解，說明益生菌晶球可穿過胃和十二指腸在腸道中釋放益生菌。

圖4 人工腸液對益生菌晶球和菌粉活菌數(shù)的影響

2.2 晶球在酸奶中的應(yīng)用

市售酸奶在生產(chǎn)和銷售過程中需要符合《GB 19302-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中的規(guī)定，且在21 d貨架期間產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等感官特性應(yīng)無顯著變化。常見問題之一是酸奶的后酸化現(xiàn)象，一些益生菌（例如grx10和LPC37）代謝產(chǎn)酸能力較強，在低溫條件下仍會繼續(xù)代謝產(chǎn)生例如乳酸、乙酸等有機酸，可能會對發(fā)酵乳的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響，因而需對添加益生菌晶球的酸奶的pH值、酸度、活菌數(shù)和感官指標(biāo)進(jìn)行測評。

2.2.1 酸奶pH值和酸度變化

為了研究益生菌晶球與酸奶混合后是否會導(dǎo)致產(chǎn)品在貨架期內(nèi)后酸化嚴(yán)重，測定了添加/不添加益生菌晶球的酸奶的pH值和酸度，結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 添加/不添加益生菌晶球的酸奶的貨架期pH值變化

圖6 添加/不添加益生菌晶球的酸奶的貨架期酸度變化

由圖5和圖6可知，添加益生菌晶球的酸奶在21 d低溫（4℃）貯藏中，酸奶部分的pH值、酸度變化與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。21 d內(nèi)三者pH值從4.40左右下降至4.15左右，酸度從90.00°T左右上升至94.00°T左右。賈慶超[24]等對兩種市售酸奶進(jìn)行貨架期性質(zhì)跟蹤發(fā)現(xiàn)，4℃密封冷藏21 d的兩種酸奶的酸度分別增加4.3°T和5.0°T，蔡超[25]也比較了兩種市售酸奶（光明和蒙牛）在5℃下貯藏21 d的酸度變化，酸度分別增加6.48°T和8.73°T，杜磊[26]等發(fā)現(xiàn)市售蒙牛原味酸奶在4℃下貯藏21 d后酸奶的酸度從74.3°T升至108.8°T，升高了34.5°T。對比可知，實驗所用原味酸奶的貨架期后酸化程度弱、貯藏穩(wěn)定性好，且益生菌晶球的添加沒有導(dǎo)致過酸影響酸奶品質(zhì)。劉絨梅[10]等對grx10的貨架期pH值和酸度變化研究表明其是一株后酸能力較強的乳酸菌，同樣郭小[14]等研究中也表明LPC37的產(chǎn)酸能力較強，但在本研究中晶球包埋處理顯著抑制了兩種益生菌的后酸化現(xiàn)象，可見益生菌經(jīng)包埋后與外環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)的接觸減少，基本不對外環(huán)境造成影響。因此，在酸奶中添加益生菌晶球能在增加產(chǎn)品益生菌含量的前提下，保持酸奶原有良好風(fēng)味。

2.2.2 酸奶和晶球中活菌數(shù)變化

為了研究益生菌晶球與酸奶混合后的產(chǎn)品在貨架期的穩(wěn)定性，分別測定了益生菌晶球酸奶中酸奶部分與晶球中的菌含量，結(jié)果如圖7所示。

圖7 晶球酸奶貨架期內(nèi)酸奶部分與晶球中活菌數(shù)的變化

由圖7可知，21 d貨架期內(nèi)，添加/不添加益生菌晶球的酸奶部分中的活菌數(shù)無顯著差異，均呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，第7天時活菌數(shù)上升約0.05個數(shù)量級，至第21 d下降約0.5個數(shù)量級，可見益生菌晶球的添加不影響酸奶部分的菌含量。并且兩種晶球中的活菌數(shù)基本保持不變，下降均不足0.1個數(shù)量級，可見酸奶的浸泡也不會對晶球中菌含量產(chǎn)生不良影響。由上述可知，晶球能夠起隔離內(nèi)外環(huán)境的作用，晶球中的益生菌被充分包埋，未泄露到外環(huán)境中，晶球中益生菌數(shù)量長時間保持不變。因此，與傳統(tǒng)酸奶相比，含益生菌晶球的酸奶能在保證美味的前提下提供更多數(shù)量的活性益生菌。

2.2.3 酸奶感官品評

不添加晶球的原味酸奶與分別添加兩種晶球的晶球酸奶的感官品評結(jié)果如見圖8所示。

由圖8可知，分別添加了grx10晶球、Lpc37晶球的兩種酸奶口感、滋味、氣味、組織狀態(tài)與無晶球酸奶（原味酸奶）相比無明顯差異，但Q彈的晶球帶來的咀嚼感提升了品評者對酸奶的整體喜愛度，可見益生菌晶球不但不會影響酸奶的品質(zhì)，且通過良好的咀嚼體驗感提升了消費者對產(chǎn)品的青睞。

圖8 添加/不添加益生菌晶球的酸奶的感官品評結(jié)果

3 結(jié)論

通過對鼠李糖乳桿菌grx10、副干酪乳桿菌Lpc37包埋前后的體外耐受性進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)pH值為2.5的人工胃液最長處理3.0 h后，grx10和Lpc37經(jīng)包埋后的活菌數(shù)與包埋前相比分別提升4.4和5.2個數(shù)量級，存活率分別為27 959和152 432倍；經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的膽鹽溶液最長處理4.5 h后，grx10和Lpc37經(jīng)包埋后的活菌數(shù)與包埋前相比分別提高了4.2和1.7個數(shù)量級，存活率分別為16 347和52倍。另外grx10和Lpc37均對人工腸液具有較好耐受性，晶球包埋后不改變該性質(zhì)且能完全溶于人工腸液。綜合可知，晶球包埋可以提高grx10和Lpc37對人工胃腸液及膽鹽的耐受性，且能在胃液、膽汁中保持不溶解、不破碎的狀態(tài)進(jìn)入腸液釋放益生菌。

通過測定添加/不添加益生菌晶球的酸奶的貨架期pH值、酸度、活菌數(shù)及感官特性可知，添加益生菌晶球不僅不會影響酸奶的pH值、酸度及活菌數(shù)，還能避免產(chǎn)酸能力較強益生菌造成的后酸化影響，另外咀嚼感良好的晶球提升了產(chǎn)品的趣味性和消費者的喜好度。綜上，晶球能夠起隔離內(nèi)外環(huán)境的作用，益生菌被晶球充分包埋不外泄，穩(wěn)定性好，能在增加產(chǎn)品益生菌含量的前提下保持酸奶原本的良好風(fēng)味。