董昳伶 肖旭騰 張 敏 沈樂意 陳天池 賈永紅 吳月燕

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315000)

成熟期調(diào)控是目前鮮食葡萄(VitisviniferaL.)的研究熱點，通過關(guān)鍵基因調(diào)控果實提前或延遲成熟、進入市場，拉長供應(yīng)期，達(dá)到最大經(jīng)濟效益。大量研究已證實，果實發(fā)育成熟受植物內(nèi)源激素的調(diào)控，其中脫落酸(abscisic acid, ABA)在調(diào)節(jié)果實成熟和衰老中起關(guān)鍵作用。ABA的生物合成途徑分為2種，一種是類萜途徑，主要存在于一些植物致病真菌中[1-2]；另一種是類胡蘿卜素途徑，為植物ABA合成的主要途徑[3]。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是調(diào)節(jié)植物ABA合成途徑的關(guān)鍵限速酶[4]，參與ABA生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]，首個編碼NCED的基因在玉米突變體中分離得到[6]。研究表明，NCED在胞質(zhì)內(nèi)合成，在轉(zhuǎn)運肽的引導(dǎo)下進入質(zhì)體，催化葉綠醇的氧化裂解反應(yīng)[7]。葡萄中VvNCED1基因在果實成熟時啟動ABA的生物合成[8]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NCED家族中有12條基因[9]，但VvNCED基因家族如何通過調(diào)節(jié)ABA從而影響葡萄果實發(fā)育尚不明確。前人研究表明，在果實成熟期前對葡萄進行環(huán)割處理可以增加果實中的ABA含量[10]，提高果實糖酸比、可溶性固形物含量[11-12]，促進果實成熟[13-14]。本試驗以鄞紅葡萄為材料，研究環(huán)割處理對葡萄成熟期的影響、內(nèi)源ABA含量的變化和VvNCED6條家族基因表達(dá)量的差異，并進行基因過表達(dá)的驗證，旨在深入了解VvNCED家族基因在ABA合成中的作用，揭示其在葡萄果實成熟中的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

鄞紅葡萄來源于浙江省寧波市鎮(zhèn)海滴翠園農(nóng)場。

RNA提取試劑盒來自天根生化科技(北京)有限公司。CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒來自北京艾德萊生物科技有限公司。引物合成由杭州擎科生物技術(shù)有限公司完成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、一步克隆試劑盒、DH5α來自上海近岸科技有限公司。質(zhì)粒提取Omega Bio-Tek試劑盒來自O(shè)mega(美國)。內(nèi)切酶NcoI-HF來自美國NEBiolabs。GV3101農(nóng)桿菌來自昂羽生物(上海)。熒光酶Perfect StartTM Green qPCR Super Mix、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。植物激素脫落酸(ABA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒來自上海科興生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 選取果園內(nèi)生長栽培管理一致、處于開花期后50 d的30株5年生鄞紅葡萄。5株為一小區(qū)，在離地面1.2 m的主干上進行環(huán)割，環(huán)割深度0.3 mm、寬度0.5 mm，以不環(huán)割為對照，重復(fù)3次，隨機排列。在處理后0、7、15、23、35和48 d分別隨機采集5穗處理與對照的葡萄果實、連接果穗處10 cm左右莖段和該莖段處的葉片。采集后一部分用于果實品質(zhì)測定，一部分于-80℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 果實品質(zhì)指標(biāo)的測定 處理與對照每穗隨機取10粒果實，測定果實品質(zhì)。果實可溶性固形物(total soluble solids, TSS)含量、總酸含量和糖酸比利用PAL-BX|ACID2便攜式數(shù)顯糖酸一體酸度計(日本愛拓)測定。果肉中的可溶性蛋白含量測定使用考馬斯亮藍(lán)法，可溶性糖含量測定使用蒽酮比色法[15]。

1.2.3 果肉、莖段和葉片中的ABA含量測定 處理與對照每穗隨機取9粒果實、3個莖段和3片葉片，根據(jù)(ELISA)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書測定葡萄果肉、莖段和葉片中的ABA含量，3次重復(fù)。

1.2.4VvNCED基因表達(dá)特性分析 根據(jù)鑒定的葡萄NCED家族基因[9]，在EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)上搜索NCED家族基因編碼區(qū)(表1)，利用Primer 6軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物(real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)(表2)。提取處理與對照的葡萄果肉、莖段和葉片的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，分組后于-20℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR按照PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix說明書操作，選用葡萄Actin為內(nèi)參，反應(yīng)在CFX96熒光定量PCR儀(美國伯樂)上進行。3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理時，設(shè)置處理0 d為初始值1，后所有數(shù)值倍數(shù)比較。

表1 基因序列信息Table 1 Information of gene sequences

1.2.5 pCambia1302-VvNCEDs植物過表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)NCED基因家族完整編碼區(qū)，pCambia1302質(zhì)粒序列和一步克隆試劑盒方法，設(shè)計插入位點以及引物(圖1、表1)。提取pCambia1302質(zhì)粒，NcoI-HF單酶切后回收線性化載體。提取鄞紅葡萄果肉RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR獲得帶有載體同源序列的VvNCED基因編碼區(qū)目的片段，體系為50 μL：cDNA 2 μL，正反引物各2 μL，2×Fast Pfu MAster Mix 25 μL，無核酸酶水補足至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min 30 s；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min，4℃條件下保存。利用一步克隆試劑盒將目的片段與線性化載體進行連接。得到重組過表達(dá)植物載體pCambia1302-VvNCEDs。連接后轉(zhuǎn)化DH5α，通過菌液PCR和測序鑒定陽性重組子。將獲得的帶有不同目的片段的重組過表達(dá)載體按照攜帶的目的片段命名為pCambia1302-VvNCED1、pCambia1302-VvNCED3、pCambia1302-VvNCED4、pCambia1302-VvNCED6、pCambia1302-VvNCED7和pCambia1302-VvNCED8。

1.2.6 GV3101轉(zhuǎn)化與葡萄花序侵染 將所構(gòu)建的pCambia1302-VvNCEDs載體與pCambia1302通過凍融法轉(zhuǎn)化GV3101，陽性篩選驗證成功后，獲得7個攜帶不同載體的農(nóng)桿菌菌株。取200 μL菌液加入含有1 mg·L-1卡那霉素和1 mg·L-1利福平的50 mL LB培養(yǎng)液中，于28℃、200 r·min-1搖床中搖至渾濁，然后用加入0.1 mol·L-1乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、0.5 mol·L-12-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid, MES)和1 mol·L-1的MgCl2的MS液體培養(yǎng)液(pH值5.8)調(diào)至OD600=0.8，得到農(nóng)桿菌侵染液。在田間隨機選擇24株生長一致的5年生鄞紅葡萄，3株為一區(qū)組，其中6組分別單獨被攜帶重組過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染，1組被攜帶空載的農(nóng)桿菌侵染，1組保持自然生長(野生型)。農(nóng)桿菌菌液浸泡花蕾期花序5 min，報紙遮光3 d后去除，每個處理重復(fù)3次。

1.2.7 DNA驗證與qRT-PCR檢測基因表達(dá)水平 根據(jù)質(zhì)粒設(shè)計驗證引物(表1)。過表達(dá)(over-expressed)、空載對照(empty vector, EV)和野生型(wild type, WT)于果實轉(zhuǎn)色期各采3穗，采樣后立即置于4℃條件下保存，采用植物DNA提取試劑盒對所有葡萄果肉進行基因組DNA提取。通過PCR反應(yīng)篩選陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉，體系為25 μL：cDNA 1 μL，正反引物各1 μL，2xEasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，無核酸酶水補足至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火2 min，72℃延伸2 min，40個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃條件下保存。取陽性的葡萄果肉進行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用1.2.4的方法，通過qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)量。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

注：35S是啟動子; mgfp5是熒光位點; LB和RB分別為左右邊界; NcoI是酶切位點。Note: 35S is promoters. mgfp5 is fluorescent marker site. LB and RB are the left and right borders respectively. NcoI is the restriction site.圖1 過表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of overexpression vector construction

1.2.8 ABA含量的測定 使用ELISA法測定陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中的ABA含量，重復(fù)3次。

1.2.9 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉果實品質(zhì)指標(biāo)的測定 取DNA檢測結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因葡萄果肉測定果實品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)，測定方法同1.2.2，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用WPS Office 19進行數(shù)據(jù)整理和繪圖，使用SPSS 24.0進行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)割處理對葡萄果實品質(zhì)的影響

環(huán)割處理后，葡萄果實提前著色(圖2)。處理和對照組葡萄果實進入轉(zhuǎn)色期的時間分別為15和23 d；處理35 d葡萄果實達(dá)到完全轉(zhuǎn)色，對照則在48 d達(dá)到完全轉(zhuǎn)色，可知處理后的葡萄果實轉(zhuǎn)色時間比對照提前13 d。

圖2 鄞紅葡萄果實外觀比較Fig.2 Yinhong grape fruit appearance comparison

隨著果實的發(fā)育，處理與對照組果實硬度、總酸和糖酸比以及果肉中的可溶性固形物、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均呈現(xiàn)較大的差異(表3)。處理后的果實成熟時間為35 d，對照果實成熟時間為48 d。處理15 d，果肉中的可溶性固形物含量是處理7 d的2.13倍；處理35 d是處理23 d的1.52倍，是對照35 d的1.23倍。處理35 d與處理48 d的總酸含量和糖酸比均無顯著差異。對照48 d的糖酸比顯著高于處理48 d。果肉中的可溶性糖含量在處理15 d是同時期對照的1.73倍；處理35 d含量最高，是同時期對照的1.28倍。處理35 d、處理48 d和對照48 d時果肉中的可溶性蛋白含量無顯著差異。

表3 環(huán)割處理對果實品質(zhì)的影響Table 3 The effect of girdling treatment on fruit quality

上述結(jié)果表明，環(huán)割處理果實著色進程明顯較快，但當(dāng)處理后的果實完全著色時，果實的總酸含量偏高，糖酸比偏低，說明處理后糖酸轉(zhuǎn)化進程慢于著色進程。

2.2 環(huán)割處理對葡萄不同組織中ABA含量的影響

葡萄果肉中，處理后ABA含量變化趨勢與對照相同，均呈先上升后下降的變化，但達(dá)到峰值的時間有所提前。處理23 d時ABA含量顯著高于對照，是其1.27倍；處理35 d是對照的0.83倍；處理48 d與對照無顯著差異(圖3-A)。ABA含量在環(huán)割處理莖段中的趨勢與果肉中相似，處理7 d上升趨勢明顯，是對照7 d的1.21倍；處理23 d低于對照，是其0.93倍(圖3-B)。ABA含量在環(huán)割處理的葉片中含量持續(xù)高于對照，且趨勢均為先上升后下降；處理23 d是對照的1.27倍，處理48 d是對照的1.94倍(圖3-C)。綜上所述，環(huán)割處理影響不同時期不同組織中ABA含量。

注：A：環(huán)剝后葡萄果肉中ABA含量的變化; B：環(huán)剝后葡萄莖中ABA含量的變化; C：環(huán)剝后葡萄葉片中ABA含量的變化。不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。下同。Note: A: Changes in ABA content in grape pulp after girdling. B: Changes in ABA content in grape stems after girdling. C: Changes in ABA content in grape leaves after girdling. Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖3 鄞紅葡萄同組織中ABA含量的變化Fig.3 Changes of ABA content in different tissues of Yinhong grape treatment and control

2.3 環(huán)割處理對VvNCEDs表達(dá)的影響

為鑒定VvNCED基因在葡萄果實生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用，采用qRT-PCR分析環(huán)割處理后VvNCED基因在葡萄果肉、莖段和葉片中的表達(dá)水平(圖4)。

注：圖中基因名稱的橫向從左到右分別為果肉、莖段、葉片。Note: The horizontal bar graph of gene names in the figure shows the pulp, stem and leaves from left to right.圖4 VvNCED家族基因在鄞紅不同組織中表達(dá)量變化Fig.4 Variation of VvNCEDs expression in different tissues between Yinhong grape

果肉中，環(huán)割處理7 d，VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7表達(dá)量顯著高于對照。處理15 d，VvNCED1、VvNCED4、VvNCED6和VvNCED8表達(dá)量顯著高于對照。處理后VvNCED1、VvNCED3和VvNCED7的表達(dá)量變化趨勢與對照不同，為持續(xù)下降。

莖段中，處理7 dVvNCED1、VvNCED3、VvNCED4、VvNCED7和VvNCED8表達(dá)量顯著高于對照。處理48 dVvNCED1表達(dá)量顯著高于同時期對照，是其3.12倍。其余時期處理后的表達(dá)量均低于對照。

葉片中，處理7 dVvNCED1、VvNCED3、VvNCED4、VvNCED6和VvNCED7表達(dá)量顯著高于對照。處理15 dVvNCED6表達(dá)量顯著高于同時期對照，是其3.25倍。其余時期處理后的表達(dá)量均低于對照。

綜上所述，果肉中的VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7的表達(dá)量在環(huán)割處理7 d后上升，表明環(huán)割處理短時間內(nèi)對這4條基因在果肉中的表達(dá)量有影響，推測其可能是葡萄果肉成熟的關(guān)鍵因子。環(huán)割后的莖段和葉片中不同基因在不同處理組中的不同時間表達(dá)量也存在變化。結(jié)果表明家族基因具有組織特異性。

2.4 重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌驗證結(jié)果

為了進一步驗證VvNCEDs在鄞紅葡萄果實成熟期的作用，構(gòu)建VvNCEDs過表達(dá)載體。重組子PCR驗證的電泳結(jié)果如圖5所示，條帶bp數(shù)正確且完整單一，測序后證明pCambia1302-NCEDs的6個重組子構(gòu)建成功。重組子構(gòu)建成功后，與pCambia1302空載一同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后再次PCR驗證(圖6)，條帶完整且單一，證明重組子成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

注：M:Marker;1:pCambia1302-VvNCED1; 2:pCambia1302-VvNCED3; 3:pCambia1302-VvNCED4; 4:pCambia1302-VvNCED6; 5:pCambia1302-VvNCED7; 6:pCambia1302- VvNCED8。圖5 pCambia1302-VvNCED載體構(gòu)建驗證Fig.5 pCambia1302-VvNCED vector construction verification

注:M:Marker;1:pCambia1302-VvNCED8;2:pCambia1302-VvNCED7;3:pCambia1302-VvNCED6;4:pCambia1302-VvNCED4;5:pCambia1302-VvNCED3;6: pCambia1302-VvNCED1。圖6 pCambia1302-VvNCED載體轉(zhuǎn)入GV3101驗證Fig.6 pCambia1302-VvNCED vector transferred to GV3101 verification

2.5 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉的篩選鑒定

提取轉(zhuǎn)基因葡萄果肉DNA，PCR反應(yīng)擴增結(jié)果顯示，陽性pCambia1302-VvNCEDs轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中含有1 664 bp單一條帶，在野生型和轉(zhuǎn)空載體的葡萄果肉中未檢測到(圖7)。

注：M: Marker;1: pCambia1302-VvNCED1. 2: pCambia1302-VvNCED3. 3: pCambia1302-VvNCED4. 4: pCambia1302-VvNCED6. 5: pCambia1302-VvNCED7. 6: pCambia1302-VvNCED8. 7: EV,空載pCambia1302轉(zhuǎn)化的葡萄花序. 8: WT: 野生型。Note: M: Marker. 1: pCambia1302-VvNCED1. 2: pCambia1302-VvNCED3. 3: pCambia1302-VvNCED4. 4: pCambia1302-VvNCED6. 5: pCambia1302-VvNCED7. 6: pCambia1302-VvNCED8. 7: EV, grape inflorescence transformed with pCambia1302. 8: WT: Wild type.圖7 轉(zhuǎn)基因葡萄果肉DNA的PCR驗證Fig.7 PCR verification of transgenic grape pulp DNA

應(yīng)用qRT-PCR分析陽性轉(zhuǎn)化的葡萄果肉中VvNCED基因的表達(dá)水平(圖8)。結(jié)果顯示，與野生型相比，被不同重組子侵染得到的陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉的基因表達(dá)量顯著提高，證明不同的目的基因在各自的陽性轉(zhuǎn)基因果肉中被過表達(dá)，尤其是VvNCED1、VvNCED4、VvNCED6和VvNCED7這4個基因，過表水平較野生型增加明顯。

注：EV: 空載pCambia1302轉(zhuǎn)化的葡萄花序；WT: 野生型。下同。Note: EV: Grape inflorescence grape inflorescence transformed with pCambia1302. WT: Wild type. The same as following.圖8 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中目的基因表達(dá)分析Fig.8 Analysis of target gene expression in positive transgenic grape pulp

2.6 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中ABA含量分析

為闡述VvNCEDs在葡萄果肉中過表達(dá)是否會引起ABA含量的改變，對陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中的ABA含量進行測定(圖9)。結(jié)果顯示，與野生型相比，不同轉(zhuǎn)基因葡萄的果肉ABA含量呈不同程度的升高，過表達(dá)VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7葡萄果肉ABA含量顯著提高，平均較野生組上調(diào)30%，過表達(dá)VvNCED6與VvNCED8葡萄果肉中的ABA平均較野生型上調(diào)10%，略低于上述4個基因。

圖9 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中ABA含量Fig.9 ABA content in positive transgenic grape pulp.

2.7 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果實品質(zhì)分析

為了闡述VvNCEDs在葡萄果肉過表達(dá)會引起葡萄果實品質(zhì)的改變，選擇陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中ABA含量增幅較大(VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7)的進行果實品質(zhì)測定。同天采集的同處于轉(zhuǎn)色期的陽性轉(zhuǎn)基因果實和野生型果實外觀對比，陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果實果皮顏色偏紫(圖10)。通過果實品質(zhì)比較后發(fā)現(xiàn)(表4)，陽性轉(zhuǎn)基因果實的硬度、總酸均顯著低于野生型，可溶性固形物、糖酸比、可溶性糖和可溶性蛋白均顯著高于野生型。上述結(jié)果說明陽性轉(zhuǎn)基因果實會提前進入成熟期。

圖10 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果實外觀比較Fig.10 Comparison of the appearance of positive transgenic grapes

表4 陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果實品質(zhì)分析Table 4 Analysis of fruit quality of positive transgenic grape

3 討論

在本研究中，環(huán)割處理后的葡萄果實提前著色，處理35 d已呈現(xiàn)成熟的外觀品質(zhì)，較對照提前13 d成熟。ABA含量隨著葡萄果實成熟進程的推進逐漸上升后下降，處理后不同時間葡萄果肉、莖段和葉片中的ABA含量與對照相比均發(fā)生了變化。ABA是葡萄果實成熟的一項重要內(nèi)源性指標(biāo)[8]，與種子萌發(fā)、休眠、葉片衰老、器官脫落和果實成熟等各種生理活動進程調(diào)節(jié)密切相關(guān)[16]。環(huán)割推進葡萄果實成熟進程，同時葡萄果肉中的ABA含量增加顯著，因此，初步斷定通過調(diào)控內(nèi)源ABA的含量有可能改變葡萄成熟進程。這與前人在不同物種中的研究取得了相同的結(jié)果，如不同柑橘葉中ABA含量在環(huán)割后會產(chǎn)生變化[17]。

NCED作為決定著ABA的合成與積累[18-21]的重要基因家族，其中VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7的表達(dá)量在果肉中環(huán)割處理7 d的果肉中，較同時期對照顯著增加，推測其表達(dá)與內(nèi)源ABA含量的變化存在相關(guān)性，表明上述基因可能參與了果肉中的ABA合成。葡萄VvNCED家族中不同的基因在環(huán)割后的不同組織中存在不同表達(dá)模式，這是因為基因的組織特異性[22]，也存在基因響應(yīng)環(huán)境脅迫的可能[9]。類似的，柑橘(Citrusclementiva)CcNCED3會在水分脅迫時特異性上調(diào)，CcNCED5則在成熟果實中被誘導(dǎo)表達(dá)[23]；單子葉植物水稻(OryzasativaL.)OsNCED3在葉片形態(tài)和發(fā)育方面具有額外的功能，OsNCED5異位表達(dá)能夠改變種子發(fā)芽與開花時間[24]。環(huán)割處理類似于環(huán)境脅迫作用，導(dǎo)致不同組織中NCED基因表達(dá)的改變，可能會間接或直接導(dǎo)致組織中內(nèi)源ABA含量變化。由此可見，本研究中VvNCED基因家族表達(dá)具有組織特異性，與前人研究結(jié)果相似，如PpNCED1與PpNCED5在桃(Prunuspersica)果實的成熟中差異表達(dá)，卻擁有協(xié)同調(diào)節(jié)ABA生物合成的能力[25]，PpeNCED2和PpeNCED3單獨的成熟誘導(dǎo)表達(dá)模式[26]。因此，本研究推測果肉中VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7表達(dá)可調(diào)控內(nèi)源ABA含量，從而影響果實成熟進程。

為了證實這一推測，本研究構(gòu)建VvNCEDs過表達(dá)體系，得到過表達(dá)VvNCEDs陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果實，并通過qRT-PCR驗證過表達(dá)果肉中目的基因表達(dá)量，測定內(nèi)源ABA含量和相關(guān)果實品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，陽性轉(zhuǎn)基因葡萄果肉中的目的基因表達(dá)水平顯著高于野生型，ABA含量也顯著高于野生型；此外，過表達(dá)VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7后的葡萄果實生長發(fā)育提前，先野生型進入成熟期。該結(jié)果進一步證實了上述4個VvNCED基因的高表達(dá)有利于提高果肉中的ABA含量，由此推測VvNCEDs的表達(dá)具有調(diào)控果實內(nèi)源ABA的能力，同時VvNCEDs可以參與葡萄果肉ABA合成，促進葡萄果實提前成熟。目前已有前人研究證明了上述推測，Leng等[27]發(fā)現(xiàn)DkNCED1(DiospyroskakiThumb.)在與果實分離后出現(xiàn)高表達(dá)，與ABA含量增加相吻合；Mojtahedi等[28]研究百合休眠時發(fā)現(xiàn)，LlNCED(Liliumlongiflorum)在高表達(dá)時，內(nèi)源ABA表現(xiàn)較高濃度；BnNCED3(BrassicanapusL.)的過表達(dá)有助于轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中ABA的積累[29]；抑制NtNCED3(NicotianatabacumL.)表達(dá)的同時內(nèi)源性ABA含量降低[30]。但不是所有VvNCED基因都會在過表達(dá)后響應(yīng)果實中的ABA變化，推測與基因表達(dá)特異性有關(guān)，VvNCED6與VvNCED8可能參與不同組織與不同生長發(fā)育時期的ABA合成。綜上所述，VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7的表達(dá)在鄞紅葡萄果肉中具有促進ABA生物合成、調(diào)控葡萄成熟期的作用。

本研究證實了NCED基因家族中VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7表達(dá)可調(diào)控葡萄果肉中的ABA合成，促進果實成熟，明確了鄞紅葡萄中VvNCEDs與ABA和果實成熟之間的關(guān)系，為鄞紅葡萄成熟期調(diào)控提供了理論依據(jù)，為進一步得到葡萄新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)割處理能夠促進葡萄果實成熟，增加不同組織不同時期中的內(nèi)源ABA含量，提高VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7基因在葡萄果肉中表達(dá)水平。同時，過表達(dá)VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7能夠顯著增加葡萄果肉中的ABA含量，促進果實的生長發(fā)育。證明VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7的表達(dá)在葡萄果實發(fā)育過程中具有調(diào)控ABA含量的作用。