孫麗慧，賀雷雨，陳業(yè)文，宮宇晴

（1.大連理工大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221；2.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸[1]，是一種廣泛分布于動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸[2]。它作為重要的抑制神經(jīng)信息傳遞的物質(zhì)[3]，能夠參與人體內(nèi)多種代謝過(guò)程，具有較高的生理活性[4]，如降血壓[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)免疫力[7]等。

GABA的合成方法主要包括化學(xué)合成法、植物富集法和微生物合成法[8]。近年來(lái)微生物法生產(chǎn)GABA已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。其原理是利用某些微生物細(xì)胞中天然含有的谷氨酸脫羧酶為催化劑，將底物L(fēng)-谷氨酸或L-谷氨酸鈉催化為GABA[9]。目前為止已在多種常見(jiàn)微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶的存在[10]，相對(duì)于化學(xué)合成法和植物富集法，微生物合成法具有污染小、成本低、轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。特別是利用細(xì)胞催化將L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化生成GABA，具有反應(yīng)體系成分較簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、分離純化操作簡(jiǎn)單以及對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)勢(shì)[13-14]。本課題組前期從榨菜中篩選出一株具有較強(qiáng)催化合成GABA能力的短乳桿菌DLF-19076，但游離細(xì)胞催化通常只能使用一次，存在轉(zhuǎn)化液容易乳化、下游分離較困難等問(wèn)題[15]，而固定化細(xì)胞具有易回收、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[16]。因此本文以實(shí)驗(yàn)室前期篩選保藏的短乳桿菌DLF-19076細(xì)胞為研究對(duì)象，利用海藻酸鈉為載體對(duì)固定化條件、固定化細(xì)胞的酶學(xué)性質(zhì)及操作穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期為生物合成GABA奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短乳桿菌DLF-19076：由大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏[17]；γ-氨基丁酸、5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5'-phosphate，PLP）（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；海藻酸鈉、L-谷氨酸鈉（均為分析純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：默克股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）：上海博升生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、無(wú)水乙酸鈉5 g/L、檸檬酸二銨 2 g/L、K2HPO42.0 g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、吐溫-80 1mL/L，使用 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的菌體活化后接入MRS培養(yǎng)基（100 mL/250 mL）中，35℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液離心10 min后（4℃、10 000 r/min），將收集的菌體用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌3次，4℃冷藏備用。

1.3.2 海藻酸鈉包埋法固定化短乳桿菌細(xì)胞

1.3.2.1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響

將5.0 mL細(xì)胞懸液分別與15.0 mL濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的海藻酸鈉溶液混合，用12號(hào)針頭注射器將混合液以60滴/min的速度滴入150 mL濃度為3.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下硬化4 h，考察海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響。

1.3.2.2 CaCl2濃度對(duì)固定化效果的影響

將5.0 mL細(xì)胞懸液與15.0 mL濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液混合，用12號(hào)針頭注射器將混合液以60滴/min的速度分別滴入150 mL濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下硬化4 h，考察CaCl2濃度對(duì)固定化效果的影響。

1.3.2.3 固定化細(xì)胞平均粒徑對(duì)固定化效果的影響

將5.0 mL細(xì)胞懸液與15.0 mL濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液混合，分別采用3、5、12、16號(hào)針頭將混合液滴入到150 mL濃度為3.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下硬化4 h，制備出平均粒徑為1.3、2.2、3.2、4.8 mm的固定化小球，考察小球粒徑對(duì)固定化效果的影響。

1.3.2.4 硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響

將5.0 mL細(xì)胞懸液與15.0 mL濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液混合，采用12號(hào)針頭將混合液滴入到150 mL濃度為3.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下分別硬化2、4、6 h和8 h，考察硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響。

1.3.2.5 固定化細(xì)胞條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞固定化條件。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.3.3 谷氨酸脫酸酶活力的測(cè)定

酶活力單位：在35℃、pH4.5條件下，1 min內(nèi)催化L-谷氨酸鈉產(chǎn)生1 μmol GABA所需要的谷氨酸脫酸酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

酶活力測(cè)定：反應(yīng)體系為0.2 mol/L的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液（pH4.5），含有 0.15 mmol/L PLP 和30 g/L L-谷氨酸鈉，加入適量菌體細(xì)胞或固定化小球，35℃水浴中反應(yīng)5 min，10 000 r/min離心2 min分離細(xì)胞，采用高效液相色譜法測(cè)定GABA的含量[18]。

相對(duì)酶活力（%）：以同組最高酶活力為參照，定義其相對(duì)酶活力為100%，酶活力與同組最高酶活力的比值即為相對(duì)酶活力，以百分?jǐn)?shù)形式表示。

比酶活力（U/g）：35℃、pH4.5條件下1.0 g濕菌體所具有的酶活力單位數(shù)。

1.3.4 固定化細(xì)胞機(jī)械穩(wěn)定性的測(cè)定

隨機(jī)選取100粒固定化小球，放入100mL含20mL檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（0.2 mol/L、pH4.5）錐形瓶中，加入50粒直徑6 mm的玻璃珠，35℃、200 r/min下振蕩6 h。完好的小球的數(shù)量占原小球總數(shù)的比率即為機(jī)械穩(wěn)定度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的形式表示，并運(yùn)用方差分析進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響

海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the immobilization

海藻酸鈉濃度對(duì)固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活力和機(jī)械穩(wěn)定度均有較大的影響。海藻酸鈉濃度過(guò)低，制備出的固定化小球質(zhì)地綿軟，機(jī)械穩(wěn)定度差。同時(shí)，由于球壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的稀疏，攪拌硬化過(guò)程易導(dǎo)致菌體泄露，菌體利用率下降。海藻酸鈉濃度過(guò)高，制備出的小球結(jié)構(gòu)致密，傳質(zhì)效果不佳，造成底物缺乏和產(chǎn)物抑制[19]。由圖1可知，隨著海藻酸鈉濃度的升高，固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活力先升高后降低，機(jī)械穩(wěn)定度則逐漸升高。當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.0%時(shí)，相對(duì)酶活力最高，但此時(shí)機(jī)械穩(wěn)定度為0.83。當(dāng)海藻酸鈉濃度升高至3.0%，相對(duì)酶活力略有降低，為98.34%，但機(jī)械穩(wěn)定度可提高至0.92。綜合考慮，選擇海藻酸鈉的最適濃度為3.0%。

2.1.2 CaCl2濃度對(duì)固定化效果的影響

CaCl2濃度對(duì)固定化效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 CaCl2濃度對(duì)固定化效果的影響Fig.2 Effect of calcium chloride concentration on the immobilization

CaCl2是固定化過(guò)程中的一個(gè)重要因素。Ca2+通過(guò)和海藻酸根離子反應(yīng)生成不溶于水的海藻酸鈣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[20]，從而將細(xì)菌包埋其中。當(dāng)CaCl2濃度過(guò)低時(shí)，兩離子的反應(yīng)程度低，凝膠交聯(lián)度差，制備過(guò)程中菌體流失嚴(yán)重；當(dāng)CaCl2濃度過(guò)高時(shí)，固定化細(xì)胞致密性高、通透性差，不利于物質(zhì)交換，不利于酶活力的發(fā)揮。由圖2可知，當(dāng)CaCl2濃度為3.0%時(shí)，相對(duì)酶活力最高。綜合考慮，選擇CaCl2的最適濃度為3.0%。

2.1.3 固定化細(xì)胞平均粒徑對(duì)固定化效果的影響

平均粒徑對(duì)固定化效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 平均粒徑對(duì)固定化效果的影響Fig.3 Effect of average particle size on the immobilization

由圖3可知，平均粒徑小于3.2 mm時(shí)，相對(duì)酶活力隨著平均粒徑的增大而提高，可能是由于固定化細(xì)胞的平均粒徑越小，機(jī)械穩(wěn)定度越低，制備過(guò)程造成的菌體流失越嚴(yán)重，因此適當(dāng)增加粒徑大小可提高相對(duì)酶活力；當(dāng)平均粒徑大于3.2 mm時(shí)，隨著粒徑的增大，相對(duì)酶活力反而降低，這可能是由于顆粒越大，球狀體的比表面積越小，固定化細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的總面積越小，且粒徑越大的固定化細(xì)胞在催化體系內(nèi)的流動(dòng)性越低，因而催化效率越差。因此，選擇3.2 mm為固定化細(xì)胞制備的最適粒徑。

2.1.4 硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響

硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響Fig.4 Effect of solidifying time on immobilization

由圖4可知，當(dāng)硬化時(shí)間為4 h時(shí)，相對(duì)酶活力最高。這可能是由于較短的硬化時(shí)間導(dǎo)致海藻酸鈉與CaCl2交聯(lián)程度不夠，導(dǎo)致機(jī)械穩(wěn)定度不高，固定化細(xì)胞在收集沖洗過(guò)程中造成了菌體的流失；而較長(zhǎng)的硬化時(shí)間導(dǎo)致海藻酸鈉與CaCl2的交聯(lián)程度過(guò)高，形成了致密的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加了底物擴(kuò)散的阻力。因此，選擇硬化的最佳時(shí)間為4 h。

2.1.5 固定化細(xì)胞條件的優(yōu)化

以比酶活力為考察指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞固定化條件，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知，對(duì)固定化細(xì)胞比酶活力影響最大的因素是海藻酸鈉濃度，其次是硬化時(shí)間、平均粒徑、CaCl2濃度，最佳固定化條件為海藻酸鈉濃度2.5%、CaCl2濃度3.0%、平均粒徑3.2 mm、硬化時(shí)間4 h。與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 固定化細(xì)胞的酶學(xué)性質(zhì)和操作穩(wěn)定性

2.2.1 固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH值

在pH值為3.0～7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖體系中測(cè)定固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 pH值對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity of immobilized cells and free cells

如圖5所示，細(xì)胞固定化后最適反應(yīng)pH值沒(méi)有變化，依然為4.5。

2.2.2 固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)溫度

在25℃～40℃測(cè)定固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 溫度對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity of immobilized cells and free cells

如圖6所示，細(xì)胞固定化后最適反應(yīng)溫度沒(méi)有變化，依然為35℃。

2.2.3 固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性

固定化細(xì)胞循環(huán)利用結(jié)果如圖7所示。

圖7 固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性Fig.7 The operation stability of immobilized cells

從圖7可以看出，固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活力下降趨勢(shì)較為緩慢。固定化細(xì)胞在重復(fù)利用第2次時(shí)，相對(duì)酶活力為初始值的91.4%，繼續(xù)重復(fù)利用至第7次后仍保持53.2%的相對(duì)酶活力，顯示出良好的操作穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究以海藻酸鈉為載體，采用包埋法對(duì)短乳桿菌細(xì)胞進(jìn)行了固定化，確定最優(yōu)固定化條件為海藻酸鈉濃度2.5%、CaCl2濃度3.0%、小球平均粒徑3.2 mm、硬化時(shí)間4 h。該固定化細(xì)胞最適pH值為4.5，最適溫度為35℃，與游離細(xì)胞相比均未改變，且表現(xiàn)出較好的操作穩(wěn)定性，重復(fù)利用至第7次后仍保持53.2%的相對(duì)酶活力。