張 暉 吳雪輝 董 斌 黃永芳

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642；3.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州510507）

油茶Camellia oleifera屬山茶科常綠小喬木，是世界四大木本油料作物之一，我國特有樹種，主要分布在我國南方亞熱帶地區(qū)。油茶除可作為優(yōu)質(zhì)食用油，還可用于高級化妝品、精油等產(chǎn)品；油茶粕可生產(chǎn)有機(jī)肥和生物農(nóng)藥；茶殼可提煉茶堿、栲膠等。近年油茶在茶籽產(chǎn)量、種植面積、產(chǎn)油量、產(chǎn)值上均處于逐年穩(wěn)步提高態(tài)勢。油茶產(chǎn)業(yè)成為南方很多產(chǎn)區(qū)加快農(nóng)村經(jīng)濟(jì)調(diào)整的特色產(chǎn)業(yè)，是扶貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。

油茶研究的熱點(diǎn)主要在提升價值方面，例如茶油抗氧化活性、皂素等的相關(guān)研究。茶粕中的茶皂素具備抗菌消炎、抗高血壓、抗?jié)B透和抑制酒精吸收等生物活性[2]。關(guān)于油茶籽的研究包括茶油、茶皂素、茶籽多糖、茶蛋白、糠醛等產(chǎn)品在醫(yī)藥、保健、日化、建材等行業(yè)中的應(yīng)用情況[3-4]。我國每年產(chǎn)生的油茶籽在100 萬t 左右，會產(chǎn)生約70 萬t/年油茶餅粕[4]。目前為止只有少數(shù)學(xué)者對茶粕的固體發(fā)酵工藝進(jìn)行研究[5]。如何有效利用油茶餅粕，特別是油茶餅粕在未進(jìn)行茶皂素去除的背景下，添加特異菌種后，會否因茶皂素的存在，其菌絲生長受到抑制進(jìn)而影響到茶粕有機(jī)肥利用，這方面一直未有人研究。本試驗(yàn)選用了作為多種植物病原菌的拮抗菌，同時也是一種生防菌的哈茨木霉Trichoderma harzianum[6]、可產(chǎn)生纖維素酶與半纖維素酶的黑曲霉Aspergillus niger[7]、以及在食品發(fā)酵方面用得比較多，能分泌蛋白酶的魯氏毛霉Mucor roxianus[8]3 種霉菌作為發(fā)酵研究對象。在設(shè)置不同環(huán)境溫度和油茶餅粕含水量時比較3 種霉菌的生長狀況[9]，進(jìn)一步分析發(fā)酵后油茶餅粕中養(yǎng)分變化，為油茶餅粕發(fā)酵有機(jī)肥利用提供相關(guān)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 本試驗(yàn)采用的菌種包括3 種霉菌，分別為哈茨木霉（簡稱木霉）、黑曲霉、魯氏毛霉（簡稱毛霉），均購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，為凍干菌種。

1.1.2 油茶餅粕 實(shí)驗(yàn)用的油茶餅粕購于廣東新大地生物科技有限公司，為未脫茶皂素的油茶餅粕，茶皂素含量在11%～12%，有效氮含量為1 134 mg/kg，有效磷含量為2 266 mg/kg，有效鉀含量為11 320 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將未脫茶皂素的油茶餅粕分裝到組培瓶中，每個組培瓶裝30.0 g，并于105 ℃下滅菌4 h（對照組不作滅菌處理）。滅菌后加入無菌水使茶餅粕最終含水量分別為40%、50%、60%、70%，分別接入試驗(yàn)用的菌體2 mL（105cfu/mL）于油茶餅粕中，材料置于20、30 、40 ℃的人工氣候箱中(表1)，試驗(yàn)進(jìn)行完全組合，每個處理3 個重復(fù)，定期觀察菌體生長情況及油茶餅粕變化。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design

1.3 數(shù)據(jù)收集與分析

在試驗(yàn)進(jìn)行第30 天將材料于60 ℃ 烘箱烘干，粉碎后過200 目篩。測定其有效氮、有效磷、有效鉀含量，測定方法參照《土壤農(nóng)化分析》[10]。數(shù)據(jù)采用SAS9.4 進(jìn)行方差分析與多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶餅粕發(fā)酵后有效氮變化

本試驗(yàn)進(jìn)行過程中，雖然油茶餅粕是置于封蓋的組培瓶中進(jìn)行，但由于在40 ℃時，水分仍然可從瓶中蒸發(fā)走，致使油茶餅粕變干，3 種菌無法在油茶餅粕中正常生長，而如果在試驗(yàn)過程中添加水分，將會使得試驗(yàn)中的茶粕含水量無法達(dá)到各處理要求，所以本試驗(yàn)結(jié)果不包括40 ℃的處理，可認(rèn)為此條件不適宜本試驗(yàn)條件的固態(tài)發(fā)酵處理。

各溫度水平間，20 ℃對有效氮含量的促進(jìn)作用優(yōu)于30 ℃(表2)，前者有效氮的均值是后者的1.18 倍，差異呈極顯著。含水量40%與60%、70%有極顯著差異，40%與50%之間差異不顯著，60%也優(yōu)于70%。結(jié)果顯示含水量在40%、50%時適合作為油茶餅粕發(fā)酵的條件，而含水量在70%時不利于養(yǎng)分的積累。

表2 油茶餅粕養(yǎng)分多重比較Table 2 Multiple comparison of nutrients in oil-tea cake

油茶餅粕經(jīng)對照發(fā)酵以及接種毛霉、木霉和黑曲霉發(fā)酵后有效氮含量見表3 所示，在對照處理中，有效氮含量除20 ℃+50%處理外，其他處理的有效氮含量均較發(fā)酵前低。接種的3 種霉，在20 ℃，含水量40%、50%和60%條件下，有效氮含量均比發(fā)酵前高，而在30 ℃，含水量50%、60%和70%時，有效氮含量均比發(fā)酵前低。

表3 油茶餅粕固體發(fā)酵后有效氮含量Table 3 The contents of available nitrogen after oil-tea cake(Camellia) fermentation

從總的結(jié)果來看，有效氮含量最高的前3 個處理分別為：毛霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20℃+40%、黑曲霉+20℃+50%，它們比發(fā)酵前油茶餅粕有效氮分別增長39.14%、30.37%、

25.68%，與同一溫度、含水量條件下的對照處理中的有效氮含量相比分別提高了50.87%、41.37%、15.16%；而有效氮含量最低的是木霉+30 ℃+70%，發(fā)酵后降低了25.96%，比同條件的對照處理少8.76%。

綜合菌種、溫度、含水量3 個因素的各水平間的鄧肯檢驗(yàn)結(jié)果，毛霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20 ℃+50%這3 種處理組合在油茶餅粕發(fā)酵有效氮養(yǎng)分增加的最優(yōu)，其發(fā)酵后有效氮含量較高。毛霉+20 ℃+40%的有效氮含量達(dá)到1 577.80 mg/kg，比相同條件對照處理的有效氮含量高51%。

2.2 油茶餅粕發(fā)酵后有效磷比較

菌種各水平間鄧肯檢驗(yàn)（表2）結(jié)果顯示黑曲霉、木霉優(yōu)于對照和毛霉，而黑曲霉與木霉之間差異不顯著，對照與毛霉之間差異也不顯著。接種黑曲霉與木霉后有效磷含量均明顯比對照組，前二者有效磷含量均值分別為3 206.40、3 132.82 mg/kg（表4），分別為對照組的1.12 倍和1.10 倍。

表4 油茶餅粕固體發(fā)酵后有效磷含量Table 4 The contents of available phosphorus after oil-tea cake(Camellia) fermentation

溫度對油茶餅粕有效磷含量有顯著影響，其中，在20℃時有效磷均值為3 068.37 mg/kg，較30℃的高。含水量鄧肯檢驗(yàn)顯示50%、60%與70%、40% 間 差 異 顯 著，而50% 與60% 之 間、70%與40%之間差異均不顯著。

油茶餅粕發(fā)酵后有效磷含量，除了木霉+30℃+40%外，其他各處理的有效磷含量均比發(fā)酵前高。有效磷含量排在前面的組合分別是黑曲霉+20 ℃+50%、毛霉+30 ℃+50%、黑曲霉+30 ℃+50%，它們較發(fā)酵前分別增加64.14%、59.00%、56.32%，其較同一條件下對照組分別高了38.98%、17.48%、15.50%；而有效磷含量最低的是毛霉+30 ℃+40%，發(fā)酵后較發(fā)酵前降低7.73%，比同條件下的對照組低8.59%。50%條件下發(fā)酵的有效磷均值最高，為3 230.24 mg/ kg，60%次之，為3 094.84 mg/ kg，40%只有2 726.5 mg/ kg。對各因素下各水平間的鄧肯檢驗(yàn)中可得出，黑曲霉+20℃+50%為最優(yōu)組合，有效磷含量分別為3 696.30 mg/kg；次優(yōu)組合為木霉+30℃+60%，其有效磷含量為3 603.4mg/kg。

2.3 油茶餅粕發(fā)酵后有效鉀比較

木霉、黑曲霉與毛霉、對照間差異顯著（表2），木霉與黑曲霉間差異性不顯著。其中，木霉作用后的有效鉀均值最高，達(dá)到11 173.5 mg/kg，而黑曲霉則為10 785.3 mg/kg。兩個溫度水平間差異不顯著。含水量50%的有效鉀均值最高，為10 723.1 mg/kg，與70%差異顯著，但與40%、60%間差異不顯著。

大部分處理組的有效鉀含量均比發(fā)酵前低（表5），其中對照+20℃+60%處理組的有效鉀含量損失最多，降低了40.02%。而接種木霉后在20℃，含水量40%、50%、60%條件下，其有效鉀含量比發(fā)酵前高，在12 500 mg/kg 左右。結(jié)合多重比較結(jié)果，可以推出較優(yōu)組合為木霉+20℃+60%、木霉+20 ℃+50%、木霉+20 ℃+40%，12 628.3、12 575.0、12 326.4 mg/kg，說明接種木霉對油茶餅粕有效鉀增加有顯著作用。

表5 油茶餅粕發(fā)酵后有效鉀含量Table 5 The contents of available potassium after oil-tea cake(Camellia) fermentation

3 結(jié)論與討論

油茶餅粕在經(jīng)過3 種霉菌發(fā)酵處理后，促進(jìn)有效氮增加的較優(yōu)組合為：毛霉+20℃+40%、黑曲霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20 ℃+50%。所有處理組的有效磷含量均有所增加，其中黑曲霉+20℃+50%組合比發(fā)酵前增加64.14%。有效鉀增長不顯著，在30℃下全部處理發(fā)酵后有效鉀的結(jié)果都比發(fā)酵前要低。推出較優(yōu)的組合為較優(yōu)組合為木霉+20℃+60%、木霉+20℃+50%、木霉+20℃+40%。

從試驗(yàn)中設(shè)置的菌種、溫度、含水量3 個因子對油茶餅粕中有效氮、有效磷和有效鉀的綜合結(jié)果來看，黑曲霉在含水量為50%時，對油茶餅粕的固態(tài)發(fā)酵總體養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化具有明顯的促進(jìn)作用。茶皂素在油茶餅粕中的含量約為11%-13%，此含量對典型革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌已具有顯著抑制效果, 通過抑制菌體蛋白質(zhì)的合成，干擾細(xì)胞的正常代謝過程[11-13]，進(jìn)而產(chǎn)生抑菌生物活性和毒殺效果[14-17]。

因此在利用油茶餅粕作為有機(jī)肥應(yīng)用有兩方面的問題需要衡量，一是以提取茶皂素后的油茶餅粕作有機(jī)肥原料，雖其有利于微生物的生長，但是，提取茶皂素后的茶粕也會損失大量的養(yǎng)分；二則是如果采用未脫茶皂素的油茶餅粕直接發(fā)酵作有機(jī)肥，必須采用對茶皂素耐受性的菌種搭配，以避免菌絲在生長過程受到抑制。在前期工作中已觀察到3 種霉菌在未脫茶皂素油茶餅粕中生長緩慢，在已脫茶皂素油茶餅粕中生長較快[9]。丁麗霞[18]利用黑曲霉對油茶粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵以降解茶皂素，說明黑曲霉對茶皂素具有一定的耐受性。Sariri 等[19]通過利用黑曲霉和植物乳桿菌對雨豆樹Sammanea saman的葉進(jìn)行處理，顯示其可以有效減少葉中的皂苷類物質(zhì)，說明黑曲霉在發(fā)酵應(yīng)用中具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。樸哲等[20]與尹永強(qiáng)[21]的研究結(jié)果顯示在針對家禽糞堆肥試驗(yàn)中，速效鉀含量明顯上升。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示有效鉀的含量普遍呈現(xiàn)下降趨勢。究其原因，可能與茶皂素的存在有關(guān)，同時，堆肥在發(fā)酵過程涉及到多種微生物共同作用[22]。本研究下一步的重心將在油茶餅粕與不同有機(jī)肥原料的復(fù)配，通過調(diào)整碳氮比和pH，構(gòu)建有利于菌體生長的環(huán)境。