陳富珍，陳麗英，王喬花，趙蓉，黃建新，曹榮昌，李珂*

(1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003； 2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

沙門氏菌(Salmonella)是革蘭氏陰性桿菌，宿主范圍廣，是人和動(dòng)物常見的共患病病原體之一，能夠引起人類的傷寒熱、腹瀉、食物中毒和敗血癥等，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大損失[1]。沙門氏菌屬可引起雞沙門氏菌病，主要包含雞白痢、雞傷寒、雞副傷寒等，雛雞感染后死亡率高，成年雞群感染后生產(chǎn)性能大幅降低，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大危害和經(jīng)濟(jì)損失[2]。近幾年，大理州不斷加快推進(jìn)畜禽業(yè)發(fā)展，有效保障全州乃至滇西人民“菜籃子”的肉食供應(yīng)，其中養(yǎng)禽業(yè)特別是養(yǎng)雞業(yè)貢獻(xiàn)了巨大的力量。隨著現(xiàn)代養(yǎng)雞商業(yè)化及養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，雞沙門氏菌的傳播更加復(fù)雜[3]，加之長期以來，由于抗生素的不科學(xué)使用，沙門氏菌的耐藥菌株不斷產(chǎn)生，不同地區(qū)菌株耐藥性不盡相同，嚴(yán)重影響了臨床防治效果，同時(shí)多種抗生素的不規(guī)范使用也嚴(yán)重危害人類的食品安全[4，5]。為了解大理州雞群沙門氏菌病流行情況及耐藥現(xiàn)狀，對(duì)大理州疑似感染發(fā)病雞群進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，為健康養(yǎng)雞、有效防控該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1病料來源

2020—2021年，采自大理州祥云、云龍、彌渡等9個(gè)縣(市)的規(guī)模場(chǎng)及散養(yǎng)場(chǎng)(戶)疑似感染雞沙門氏菌病的病雞肝臟組織，共計(jì)15份病料，-50℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基與試劑

沙門志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基(SS)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏試紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司；革蘭氏染色液及其他常規(guī)試劑由大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3儀器和設(shè)備

數(shù)顯生化培養(yǎng)箱(上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司)、全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅)、電熱恒溫干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、電子天平(奧豪斯儀器有限公司)、無菌超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)、雙目生物顯微鏡〔奧林巴斯(中國)有限公司〕、PCR擴(kuò)增儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、標(biāo)準(zhǔn)玻片等。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離培養(yǎng)

無菌操作，分別采集發(fā)病雞的肝臟組織1g，加入5mL RV沙門菌增菌液中，37℃培養(yǎng)12h，用于沙門氏菌選擇性增菌培養(yǎng)。用接種環(huán)蘸取菌液分別在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)和SS瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18～24h，再挑取可疑單個(gè)菌落接種于SS瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2染色鏡檢

用接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)后疑似沙門氏菌的單個(gè)菌落均勻涂抹在事先準(zhǔn)備好滴有一滴蒸餾水的載玻片上，自然晾干，火焰固定，革蘭氏染色干燥后鏡檢。

1.2.3生化試驗(yàn)

分別對(duì)分離純化的疑似病原菌挑取單個(gè)菌落，接種于生化反應(yīng)管中，37℃孵育48h后觀察結(jié)果。生化反應(yīng)試驗(yàn)包括：三糖鐵試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、山梨醇試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、氰化鉀試驗(yàn)、β-半乳糖苷(ONPG)試驗(yàn)等。

1.2.4血清型鑒定

用生理鹽水制備菌懸液，按照沙門氏菌屬診斷血清說明書進(jìn)行，先取診斷血清1～2滴于潔凈玻片上，后取少量待檢菌苔與血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，1min內(nèi)呈現(xiàn)明顯凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性，同時(shí)用生理鹽水設(shè)置陰性對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.5分離菌株多重PCR鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取分離純化后的菌株DNA。根據(jù)禽沙門氏菌病診斷技術(shù)(NY/T 2838—2015)方法進(jìn)行沙門氏菌多重PCR鑒定。引物及PCR產(chǎn)物大小，見表1。PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL、10nmol/μL混合引物5μL、ddH2O 6.5μL、DNA模板1μL，總體積25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s、56℃退火30s、72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表 1 引物及PCR產(chǎn)物大小

1.2.6藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片擴(kuò)散法(K-B)測(cè)定分離株對(duì)28種臨床抗菌藥物的敏感性。在SS瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布待測(cè)菌株，貼好藥敏片后于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑的大小，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (NCCLS) 2010年標(biāo)準(zhǔn)判定敏感性，分為敏感(S)、中敏(I)和耐藥(R)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的培養(yǎng)特性及鏡檢結(jié)果

分離純化的菌株，經(jīng)過24 h的RV沙門菌增菌液培養(yǎng)后菌液由原本的透明深藍(lán)色變淺藍(lán)色渾濁，管底有灰白色沉淀。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)上為無色半透明、光滑、邊緣整齊的菌落；在 SS 培養(yǎng)基可看到呈露珠樣的細(xì)小無色透明、圓整、濕潤和光滑的菌落，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色；挑取純化培養(yǎng)后的單個(gè)菌落革蘭氏染色，顯微鏡油鏡下觀察細(xì)菌的染色特性，可見細(xì)菌呈革蘭氏陰性短桿菌。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離到的6株疑似雞沙門氏菌分別挑選單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，接種到細(xì)菌新型生化鑒定管里進(jìn)行鑒定。結(jié)果由表2可知，三糖鐵瓊脂試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶、甘露醇試驗(yàn)均為陽性；靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、氰化鉀試驗(yàn)、山梨醇試驗(yàn)、β-半乳糖苷(ONPG)試驗(yàn)均為陰性，符合沙門氏菌屬的生化特性。

表2 6株雞源沙門氏菌生化鑒定結(jié)果

2.3 血清型鑒定結(jié)果

根據(jù)沙門氏菌屬O多價(jià)A-F群血清、H血清、Vi因子血清鑒定結(jié)果，參照沙門氏菌診斷抗原表，確定S1、S2、S3、S4菌株屬于D群雞傷寒沙門氏菌，其抗原式為：O抗原1(+)、9(+)、12(+)，H抗原(-)、(-)；S5、S6菌株屬于D群雞白痢沙門氏菌，其抗原式為：O抗原9(+)、12(+)，H抗原(-)、(-)。

2.4 分離菌多重PCR鑒定結(jié)果

由圖1可知，提取分離菌基因組 DNA 作為模板，利用沙門氏菌多重混合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6株分離菌的電泳檢測(cè)目的條帶大小與預(yù)期一致。結(jié)果顯示：S1、S2、S3、S4菌株均擴(kuò)增出495bp、252bp和174bp大小的3個(gè)條帶，確定為雞傷寒沙門氏菌；S5、S6菌株均擴(kuò)增出495bp和252bp大小的兩個(gè)條帶，確定為雞白痢沙門氏菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

利用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離出的雞沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果由表3可知，不同菌株對(duì)抗生素的敏感性存在一定的差異，多數(shù)菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、紅霉素、克林霉素、多粘菌素B、利福平耐藥；對(duì)新霉素、四環(huán)素中度敏感；對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢他啶、卡那霉素、慶大霉素、 阿米卡星、妥布霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、左氟沙星敏感。

M：DL2000 DNA Marker；1：S1菌株；2：S2菌株；3：S3菌株；4：S4菌株；5：S5菌株；6:S6菌株。

表3 6株雞源沙門氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

沙門氏菌病是人畜共患的一種細(xì)菌性疾病，血清型較多，感染譜較廣，可以在人與動(dòng)物之間通過直接接觸傳播[6]。有研究表明，世界上20%的家禽產(chǎn)品受到沙門氏菌的污染，其可以通過生物膜的形成在動(dòng)物和人類的環(huán)境和設(shè)施中長期存在[7，8]。有資料統(tǒng)計(jì)，在我國70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起的，而引起沙門氏菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品[9，10]。雞沙門氏菌感染雛雞導(dǎo)致拉稀、糊肛等癥狀，死亡率較高；感染成年雞常引起腹膜炎、輸卵管炎或隱性感染等，可垂直傳播，給養(yǎng)雞業(yè)造成極大困擾[11，12]。目前，防控沙門氏菌國內(nèi)尚無商品化的相關(guān)疫苗，主要依靠抗生素藥物治療和不斷檢疫凈化[13]。隨著抗生素的不科學(xué)、不合理使用，大量細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，沙門氏菌對(duì)抗菌藥耐藥性也日益嚴(yán)重，耐藥范圍擴(kuò)大和耐藥水平增高已成為影響全球公共衛(wèi)生安全的重要問題[14-16]。

本試驗(yàn)通過對(duì)大理州疑似雞沙門氏菌感染的病死雞進(jìn)行檢測(cè)，從肝臟組織中分離出病原菌，根據(jù)分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)特點(diǎn)及生化試驗(yàn)初步判定為沙門氏菌，再通過血清型鑒定及多重PCR鑒定，確定6株分離菌株分屬于D群沙門氏菌的雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌。本研究利用28種抗生素對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)6株分離菌對(duì)這28種抗生素的敏感性存在差異，不同菌株表現(xiàn)出不同的耐藥性，多數(shù)菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、紅霉素、克林霉素、多粘菌素B、利福平耐藥；對(duì)新霉素、四環(huán)素中度敏感；對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢他啶、卡那霉素、慶大霉素、 阿米卡星、妥布霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、左氟沙星敏感。從不同地區(qū)、不同雞場(chǎng)中分離出的沙門氏菌耐藥性存在差異，主要原因是不同地區(qū)因氣候、環(huán)境因素不同，雞沙門氏菌流行菌株不一樣，加上各養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)使用抗生素的種類、使用方法、濃度、次數(shù)也不盡相同。因此，臨床用藥需要因場(chǎng)而異，有能力的養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)定期開展細(xì)菌藥敏監(jiān)測(cè)，篩選高度敏感藥物進(jìn)行治療，并且制定合理、科學(xué)的使用方法。近年來，聯(lián)合用藥是治療畜禽細(xì)菌病的良方，可以對(duì)上述篩選出來的敏感藥物加以研究，聯(lián)合用藥，避免耐藥菌株出現(xiàn)，能有效防治雞沙門氏菌引起的細(xì)菌性疾病。