張敏星，周 游，許 玫，陳文品

（1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，重慶 404155；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

紅曲菌隸屬真菌界（Eumycophyta）、子囊菌門（Ascomycota）、真子囊菌綱（Euascomycetes）、散子囊菌目（Eurotiales）、紅曲菌科（Monascaceae）、紅曲屬（Monascus）[1]。紅曲霉是腐生真菌，生長的最適pH值為3.5～5.0，嗜乳酸，耐10%乙醇，生長溫度為26～42℃，最適溫度32～35℃。1979年，Akira Endo[2]從紅色紅曲霉（Monascus ruber）中分離出一種膽固醇合成抑制劑Monacolin K，即洛伐他汀，具有良好的血脂調(diào)解功能，被廣泛應(yīng)用于高血脂癥的治療中。紅曲米是以大米為主要原料經(jīng)紅曲菌發(fā)酵而成，在我國已有1 000多年的應(yīng)用歷史，是紅曲霉菌種選育常見的分離材料[3]。

2003年，普洱茶中首次發(fā)現(xiàn)了有洛伐他汀的存在[4]，隨后還發(fā)現(xiàn)洛伐他汀是普洱茶中發(fā)現(xiàn)的唯一他汀類化合物[5]，此后陸續(xù)有報(bào)道在普洱茶中檢測到洛伐他汀，尤其是陳年普洱茶中，但并不是所有普洱茶中都存在[6-7]。普洱茶有減肥茶、美容茶、益壽茶等美稱，大量科學(xué)研究顯示普洱茶對(duì)人和動(dòng)物具有降血脂功效[8-10]，相比綠茶、烏龍茶、紅茶等降脂功效更顯著[11-12]，可能與普洱茶中特有的降脂成分洛伐他汀有關(guān)[13]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)普洱茶中產(chǎn)洛伐他汀微生物開展了研究[14-15]，但鮮有報(bào)道從普洱茶中分離到紅曲霉。

以紅曲米和普洱茶為原料，通過不同分離方法進(jìn)行紅曲霉菌種的分離，目的是為了更好挖掘降脂紅曲霉種質(zhì)資源，揭示降脂功能食物與紅曲霉之間的關(guān)系，為后續(xù)研究紅曲霉與洛伐他汀降脂普洱茶之間的關(guān)系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種分離材料

紅曲米：市售的2種紅曲米。

茶葉：4個(gè)不同發(fā)酵程度普洱熟茶、2個(gè)不同年份陳年普洱茶，共6個(gè)茶樣。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，切碎成丁，加水煮沸30 min，紗布濾渣，加無水葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加熱攪拌，冷卻后定容至1 000 mL，高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）：稱取麥芽粉，加4倍60℃的水，在65℃水浴中糖化3～4 h，糖化程度用碘液滴定（不變藍(lán)色即可），紗布過濾，濾液稀釋至約10 Brix，加入2%瓊脂，于121℃下滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基（MA）：直接使用麥芽汁培養(yǎng)基藥品配制，即取130.1 g麥芽粉（含氯霉素），加水至1 000 mL，混勻，于121℃下滅菌20 min。

1.3 分離方法

點(diǎn)接法直接分離：在雙人雙面超凈工作臺(tái)上，將材料以三點(diǎn)法點(diǎn)接在PDA培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種分離，操作完成后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

稀釋涂布平板法：分別取1 g材料，加入9 mL無菌水，然后依次稀釋至300倍、9 000倍、270 000倍的不同濃度，取0.2 mL涂布接種于MEA培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)3皿。

選擇性平板分離法：用無菌水按1%冰醋酸和5%乙醇配制pH值為3的處理液，將分離材料于處理液中活化24 h，再涂布接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

選擇性液體分離法：含10%的無水乙醇、pH值為3的麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行分離。

1.4 純化方法

待培養(yǎng)基中長出肉眼可見大小不同的菌落，采用菌絲頂端純化法，接種到PDA和MEA培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)觀察，直到所見菌落形態(tài)可判定為同一種菌種。

1.5 鑒定方法

（1）菌落形態(tài)鑒定方法。將已分離的紅曲菌株采用3點(diǎn)法分別接種到MEA、PDA平板培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7 d，觀察并記錄菌落特征。菌落形態(tài)特征包括菌落大小、顏色、質(zhì)地、厚薄、紋飾、邊緣形態(tài)、滲出物及色素等。

（2）個(gè)體顯微形態(tài)鑒定。直接制片觀察法[16]，即從生長7 d的菌落上用鑷子挑取少量菌絲體，放在預(yù)先擦凈并滴有乳酸石炭酸-苯酚溶液或者蒸餾水的載玻片上，用解剖針和鑷子小心地將菌絲分散開來，蓋上潔凈蓋玻片，置于生物顯微鏡下觀察，并記錄觀察結(jié)果。個(gè)體顯微形態(tài)包括菌絲特征、閉囊殼特征、分生孢子形態(tài)特征等。

關(guān)于分離菌株在菌落形態(tài)和個(gè)體顯微形態(tài)的鑒定是否屬于紅曲霉屬，參考學(xué)者李忠慶等人[1，17]的分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉的分離

對(duì)紅曲霉進(jìn)行分離時(shí)，分離方法采用材料點(diǎn)接法、稀釋涂布平板法和選擇性排他培養(yǎng)法，分離培養(yǎng)基采用半合成培養(yǎng)基（PDA、MEA）、加酸加醇的處理液和加酸加醇的麥芽汁液體培養(yǎng)基進(jìn)行分離，最終從紅曲米中分離到9株紅曲霉，普洱茶中沒有分離到紅曲霉。

2.1.1 不同分離方法的分離效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同分離方法，尤其是培養(yǎng)條件不同，分離效果不同。試驗(yàn)中，采用加酸加醇選擇性培養(yǎng)手段，創(chuàng)造適于紅曲霉生長的條件進(jìn)行分離，效果最好，分離到的基本都是紅曲霉屬菌種。采用點(diǎn)接法及稀釋涂布平板法在半合成培養(yǎng)基上能分離到紅曲霉，但同時(shí)也分離出曲霉屬、青霉屬、酵母菌等其他微生物，進(jìn)而影響到紅曲霉菌株后續(xù)的分離純化。

紅曲霉具有嗜酸耐乙醇的生長特性，但生長速度較緩慢，在平板分離純化中容易被其他絲狀真菌覆蓋而難以被分離純化出來，目前對(duì)可培養(yǎng)紅曲霉的分純方法有直接分離法和排他分離法[18]，總結(jié)紅曲霉分離純化的簡易方法，在培養(yǎng)條件中加入乳酸和酒精以抑制其他微生物生長，可達(dá)快速分離紅曲霉的目的[19]。

2.1.2 不同培養(yǎng)基的生長對(duì)比

在紅曲霉的分離及后期純化過程中，同種材料、同種紅曲霉菌株在不同培養(yǎng)基上生長表現(xiàn)不同。

紅曲霉在不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)見圖1。

圖1 紅曲霉在不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)

在PDA培養(yǎng)基上，紅曲霉生長明顯受到一定程度的限制，菌落直徑小、較薄，表面的菌絲短而稀疏，菌落背面分泌色素多為紅色或粉紅色物質(zhì)。在MEA培養(yǎng)基上，紅曲霉生長旺盛，菌落直徑大、有一定厚度，表面菌絲密而長、多數(shù)呈絨毛狀，菌落背面分泌色素多為橙黃色物質(zhì)。

2.2 紅曲霉的純化

在紅曲霉的分純過程中發(fā)現(xiàn)，其生長表現(xiàn)易受外界條件影響，同一菌株在相同培養(yǎng)基上培養(yǎng)相同時(shí)間，菌落形態(tài)特征存在差異。推測可能是紅曲霉純化接種操作過程中培養(yǎng)皿內(nèi)氧氣含量不同而導(dǎo)致的，因此在試驗(yàn)中選取了一株紅曲霉進(jìn)行氧氣對(duì)生長表現(xiàn)影響的試驗(yàn)。將紅曲霉菌株以三點(diǎn)法接種在MEA培養(yǎng)基中，保鮮膜包扎后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3次重復(fù)。菌株培養(yǎng)7 d后，分別進(jìn)行脫膜透氣處理和不脫膜處理。

氧氣對(duì)紅曲霉生長表現(xiàn)的影響見圖2。

圖2 氧氣對(duì)紅曲霉生長表現(xiàn)的影響

由圖2可知，接種7 d后（圖2（a）和（b）），可見菌落表面白色，氣絲密、絨毛狀；菌落背部橙黃，有一明顯橙色同心圈，邊緣氣絲長、淺黃色。7 d時(shí)，將其中一培養(yǎng)皿進(jìn)行脫膜透氣處理，透氣處理后（圖2（c）和（d）），菌落長勢變化較大，表面氣絲在脫膜后生長旺盛，到14 d時(shí)略顯衰落，菌落背面橙紅，色素分泌明顯增多。未經(jīng)脫膜透氣處理（圖2（e）和（f）），菌落生長緩慢，在培養(yǎng)至14 d時(shí)，其長勢相較透氣處理差異明顯，相較7 d時(shí)則變化差異不大。結(jié)果表明，紅曲霉在不同氧氣環(huán)境中生長表現(xiàn)不同，充足的氧氣環(huán)境有利于紅曲霉分泌色素物質(zhì)，積累代謝產(chǎn)物。

此外，在紅曲霉的分純過程中還發(fā)現(xiàn)，紅曲霉受到青霉、曲霉、酵母等其他微生物污染時(shí)，接觸部位紅曲色素分泌量增多、差異顯著，且氣生菌絲較長。

其他微生物與紅曲霉共生時(shí)紅曲霉生長表現(xiàn)圖見圖3。

圖3 其他微生物與紅曲霉共生時(shí)紅曲霉生長表現(xiàn)圖

微生物的生長代謝受營養(yǎng)供給影響，當(dāng)多種微生物共存時(shí)，會(huì)在營養(yǎng)、空氣等方面存在競爭或合作等交互關(guān)系，進(jìn)而影響生長表現(xiàn)。由此可見，紅曲霉的生長代謝易受外界條件影響，如對(duì)紅曲霉的鑒定進(jìn)行到具體菌種時(shí)，除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，借助分子生物學(xué)鑒定顯得十分必要。

2.3 紅曲霉的鑒定

通過紅曲米和普洱茶中紅曲霉的分離純化及鑒定，最終共分離到9株紅曲霉。

不同紅曲菌在MEA斜面培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖見圖4，不同紅曲霉的形態(tài)特征觀察記錄見表1。

表1 不同紅曲霉的形態(tài)特征觀察記錄

圖4 不同紅曲菌在MEA斜面培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖

9株菌的菌落形態(tài)特征表現(xiàn)為菌落初期為白色，后期變?yōu)辄S色、橙黃、粉色、橙紅色、紫紅色等，表面菌絲多為絨毛狀、多數(shù)密而長、少數(shù)較稀疏，多有顆粒狀物質(zhì)，部分有水珠分泌，背部有規(guī)則或不規(guī)則輻射紋。9株菌的個(gè)體顯微形態(tài)特征表現(xiàn)為菌絲均有橫隔、透明而多核、少數(shù)菌絲較寬；都有閉囊殼結(jié)構(gòu)；分生孢子多數(shù)單生、呈球形，也有2～6個(gè)向基式鏈狀著生的。對(duì)比這9株菌株的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)，符合紅曲霉屬分類標(biāo)準(zhǔn)中的形態(tài)特征，可確定為紅曲霉屬微生物。

2.4 2種材料分離結(jié)果的對(duì)比分析

2.4.1 紅曲米中紅曲霉的分離結(jié)果

試驗(yàn)從紅曲米和普洱茶中分離紅曲霉，紅曲米中分離到9株紅曲霉，普洱茶中沒有分離到紅曲霉。紅曲米是以大米為主要原料經(jīng)紅曲菌發(fā)酵而成，在我國已有1 000多年的應(yīng)用歷史，性溫、味甘、無毒，具消食活血、健脾溫胃等功效，紅曲米的功效與紅曲霉密切相關(guān)[3]。目前，對(duì)紅曲霉菌種的選育，主要從紅曲發(fā)酵產(chǎn)品中獲得，多數(shù)分離材料是紅曲米[20-21]，也有從酒醅、紅腐乳、老陳醋中進(jìn)行分離，結(jié)果都能分離到紅曲霉。因此，紅曲米成為諸多學(xué)者選育降脂紅曲霉最常見、分離效果最好的材料之一。試驗(yàn)分離到9株紅曲霉，都來自紅曲米，也證實(shí)紅曲米確實(shí)是紅曲霉菌種選育的良好材料。

2.4.2 普洱茶中紅曲霉的分離結(jié)果

試驗(yàn)中選用了6個(gè)普洱茶樣作分離材料，包括4個(gè)不同發(fā)酵程度普洱熟茶、2個(gè)不同年份陳年普洱茶（均為20年以上），共6個(gè)茶樣，都未分離到紅曲霉。根據(jù)前人對(duì)普洱茶中他汀類物質(zhì)的研究可知，陳年普洱茶中有檢測到洛伐他汀，并不是所有普洱茶中都存在[6-7]。試驗(yàn)選擇20年陳年普洱茶為分離材料，同時(shí)考慮到普洱熟茶中天然存在黑曲霉、青霉、根霉、酵母等優(yōu)勢菌群可能會(huì)干擾紅曲霉的分離，采用直接分離和加酸甲醇選擇性分離法，都未分離到紅曲霉。

試驗(yàn)結(jié)果表明，茶普洱茶中可能沒有紅曲霉存在或紅曲霉種類和數(shù)量極少，因此分離不到或較難分離到紅曲霉。

3 結(jié)論

紅曲霉具嗜酸耐乙醇的生長特性，在分離時(shí)可通過添加乳酸和酒精，有助于抑制其他微生物生長而達(dá)到快速分離紅曲霉的目的。紅曲霉在受到營養(yǎng)供給、氧氣供給及其他微生物等外界條件影響時(shí)，出現(xiàn)色素分泌增多、菌絲生長旺盛的表現(xiàn)，使得與純菌株時(shí)形態(tài)特征表現(xiàn)不同，因此對(duì)紅曲霉的鑒定到具體菌種時(shí)，借助分子生物學(xué)手段十分必要。

通過紅曲米和普洱茶對(duì)紅曲霉的分離純化及鑒定，試驗(yàn)最終共分離到9株紅曲霉，其形態(tài)特征表現(xiàn)為菌落初期為白色，后期因分泌色素而變?yōu)辄S色、橙、粉色、紫紅色等；個(gè)體顯微形態(tài)上菌絲均有橫隔，有閉囊殼結(jié)構(gòu)，分生孢子多數(shù)單生、呈球形。

紅曲米中分離到9株紅曲霉，普洱茶中未分離到紅曲霉。結(jié)合前人研究結(jié)果可知，紅曲米是選育紅曲霉的良好材料，而普洱茶存在的洛伐他汀是否與紅曲霉有直接關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。