王小文 謝金龍 朱曉蕓 譚可為 陳 林

(1 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二二醫(yī)院血液腫瘤科，湖南省衡陽市 421002，電子郵箱：xlvbxv@163.com；2 南華大學附屬第二醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學科，湖南省衡陽市 421001)

肺腺癌屬于非小細胞肺癌的一種類型，是呼吸系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，嚴重威脅患者的生命健康[1]。近年來，分子靶向藥物已經成為治療肺腺癌的主要方法之一，吉非替尼屬于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)藥物，其作用機制為阻礙EGFR通路傳遞信號，最終達到抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的目的[2]。雖然與常規(guī)化療藥物相比，肺腺癌患者對EGFR-TKI吉非替尼的耐受性較好，但有研究顯示，絕大多數(shù)患者的治療有效性并不持久，多在用藥7～12個月后出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，臨床表現(xiàn)為病灶進一步生長或者轉移[3]。因此尋找有效治療吉非替尼耐藥的肺腺癌患者的藥物，對抑制病灶進一步生長、改善預后具有重要的意義。基于此，本研究探討阿法替尼聯(lián)合培美曲塞+卡鉑化療治療吉非替尼耐藥肺腺癌患者的療效。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月至2018年3月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二二醫(yī)院、南華大學附屬第二醫(yī)院收治的149例吉非替尼耐藥肺腺癌患者為研究對象。納入標準：(1)符合《中國非小細胞肺癌放射治療臨床指南(2020版)》[4]中肺腺癌的診斷標準，經病理組織學確診，且處于中晚期；(2)對吉非替尼耐藥，治療失?。?3)預計生存期≥3個月；(4)卡氏功能狀態(tài)評分≥60分。排除標準：(1)合并其他腫瘤者；(2)不能耐受本研究藥物者；(3)局部病灶或者遠處轉移病灶不可測量和評估者；(4)心、肝、腎、骨髓等功能明顯異常者；(5)合并嚴重感染性疾病者；(6)精神障礙、溝通障礙者。按照隨機數(shù)字表法將患者分為化療組74例和聯(lián)合組75例?；熃M中男性35例、女性39例，患者年齡35～67(48.45±12.65)歲；原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結-遠處轉移分期：Ⅲ期32例，Ⅳ期42例；病灶部位：右上肺葉8例，右下肺葉7例，左上肺葉31例，左下肺葉28例。聯(lián)合組中男性31例、女性44例，患者年齡35～65(47.50±11.75)歲；原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結-遠處轉移分期：Ⅲ期33例，Ⅳ期42例；病灶部位：右上肺葉9例，右下肺葉10例，左上肺葉30例，左下肺葉26例。兩組患者的性別、年齡、原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結-遠處轉移分期和病灶部位比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。患者及家屬均對本研究知情同意，本研究經中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二二醫(yī)院和南華大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：化療組患者采用培美曲塞+卡鉑化療方案進行治療。在開始化療前給予患者葉酸、地塞米松預處理。化療方案為500 mg/m2培美曲塞(南京先聲東元制藥有限公司，國藥準字：H20133216)于第1天靜脈滴注；400 mg/m2卡鉑(中國齊魯制藥有限公司，國藥準字：H10920028)于第2天靜脈滴注；21 d為1個化療周期，連續(xù)行2個化療周期。聯(lián)合組在化療組的基礎上口服阿法替尼治療，患者餐前至少1 h或者餐后2 h口服40 mg阿法替尼(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國藥準字：J20170029)，1次/d，21 d為1個療程，連續(xù)用藥2個療程。

1.2.2 腫瘤標志物檢測：于治療前、兩個療程結束后1 d抽取患者清晨空腹靜脈血3 mL，常溫下3 000 r/min離心15 min(離心半徑為3 cm)分離上層血清，-80℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測腫瘤標志物糖類抗原199、癌胚抗原、人細胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,CYFRA21-1)水平。檢測儀器為羅氏Cobas e601全自動電化學發(fā)光分析儀。糖類抗原199 ELISA試劑盒由上海臻科生物科技有限公司提供(貨號：ZK-2042)，癌胚抗原 ELISA試劑盒由上海奧陸生物科技有限公司提供(貨號：F2725-B)，CYFRA21-1 ELISA試劑盒由上海富雨生物科技有限公司提供(貨號：FY-03722H2)。RNA提取試劑盒購自深圳市紐邦生物技術有限公司(批號：55000)。

1.2.3 腫瘤增殖、凋亡基因及長鏈非編碼RNA相對表達水平的檢測：于治療前、兩個療程結束后1 d抽取患者外周靜脈血3 mL，分離出單個核細胞，之后采用TRIzol法提取單個核細胞中的總RNA，RNA提取試劑盒購自深圳市紐邦生物技術有限公司(批號：55000)提取完成后進行RNA純度、含量測定，使用TaKaRa公司的試劑盒將其反轉錄為cDNA，反轉錄試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司(批號：YDJQ3013)，采用實時熒光定量PCR法測定患者外周血單個核細胞中B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)mRNA、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)mRNA及小核仁RNA宿主基因(small nucleolar RNA host gene,SNHG)12、SNHG15、SNHG16的表達。PCR反應試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(批號：RFT100-JXV)。反應體系包括上下游引物各0.4 μL、cDNA模板1 μL、SYBR Green 10 μL，加蒸餾水至20 μL。反應條件為95℃預變性1 s、95℃ 5 s、60℃ 31 s，共進行40個循環(huán)。Bcl-2引物序列:上游5′-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3′，下游5′-CGGTGCTTGGCAATTAGTGG-3′；Bax引物序列:上游5′-ATGGAGCTGCAGAGGATTCG-3′，下游5′-AATGTCCAGCCCATGATGGT-3′；SNHG12引物序列:上游5′-AATTCTCGGCAATCACCACT-3′，下游5′-AGCGAGGAGAGGACTGGAAT-3′；SNHG15引物序列:上游5′-CCTAGTGAGGAGTGGAGCTGA-3′，下游5′-CTCATTCTGGAAGCAGAGAACC-3′；SNHG16引物序列:上游5′-GACTACAGGCGCGTACCTTC-3′，下游5′-GAAGCTGAGGCAGGCAGAT-3′；β-肌動蛋白(內參)引物序列:上游5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游5′-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3′。使用2-ΔΔCt法計算上述各基因的相對表達水平。

1.2.4 臨床療效評價：兩個療程結束后1 d參照實體瘤療效評價標準RECIST 1.1[5]評估兩組患者的臨床療效。臨床療效分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進展?；颊咚心繕瞬≡罹橥耆徑?；患者基線病灶最大徑之和至少減少30%為部分緩解；患者基線病灶最大徑之和減少但未達到部分緩解標準，或者基線病灶最大徑之和增加但未達到疾病進展標準為疾病穩(wěn)定；患者基線病灶最大徑之和至少增加20%，或者出現(xiàn)新的病灶為疾病進展。臨床緩解率=(完全緩解+部分緩解)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.2.5 毒副反應發(fā)生情況：依據世界衛(wèi)生組織頒布的抗癌藥物急性與亞急性毒性反應評估標準[6]，記錄在治療過程中患者發(fā)生白細胞減少、脊髓抑制、消化道反應(惡心、嘔吐)、肝腎功能損害等藥物毒性反應的情況。

1.2.6 生存情況：兩個療程結束后對患者進行為期2年的隨訪，統(tǒng)計其生存情況，包括無進展生存期、總生存期以及2年存活率，其中從治療開始至腫瘤進展或復發(fā)的時間為無進展生存期，從治療開始至死亡或者末次隨訪的時間為總生存期。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用GraphPad Prism制作生存曲線，采用log-rank檢驗比較生存曲線間的差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者腫瘤標志物水平的比較 治療前，兩組患者的糖類抗原199、癌胚抗原、CYFRA21-1水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；治療后，兩組患者的糖類抗原199、癌胚抗原、CYFRA21-1水平均低于治療前，且聯(lián)合組以上指標水平低于化療組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者腫瘤標志物水平的比較(x±s，μg/L)

2.2 兩組患者腫瘤增殖和凋亡基因mRNA相對表達水平的比較 治療前，兩組患者的Bcl-2和Bax的mRNA相對表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；與治療前相比，治療后兩組患者的Bcl-2 mRNA相對表達水平降低，Bax mRNA相對表達水平升高，且聯(lián)合組Bcl-2 mRNA相對表達水平低于化療組，Bax mRNA相對表達水平高于化療組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者腫瘤增殖和凋亡基因mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.3 兩組患者SNHG12、SNHG15和SNHG16相對表達水平的比較 治療前，兩組患者的SNHG12、SNHG15和SNHG16相對表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；治療后，兩組患者的SNHG12、SNHG15、SNHG16相對表達水平均低于治療前，且聯(lián)合組均低于化療組(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者SNHG12、SNHG15、SNHG16相對表達水平的比較(x±s)

2.4 兩組患者臨床療效的比較 聯(lián)合組、化療組患者的臨床緩解率分別為62.67%(47/75)、45.95%(34/74)，前者高于后者(χ2=4.198，P=0.041)。見表4。

表4 兩組患者臨床療效的比較(n)

2.5 兩組患者毒副反應發(fā)生情況的比較 化療組、聯(lián)合組的毒副反應總發(fā)生率分別為14.86%(11/74)、17.33%(13/75)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.168，P=0.682)。見表5。

表5 兩組患者毒副反應發(fā)生情況的比較(n)

2.6 兩組患者生存情況的比較 聯(lián)合組患者的中位無進展生存期為35.58個月，長于化療組的30.52個月(χ2=11.756，P=0.008)。見圖1。聯(lián)合組患者的中位總生存期為42.63個月，長于化療組的36.00個月(χ2=11.021，P=0.009)；聯(lián)合組患者的2年存活率為93.33%(70/75)，高于化療組患者的59.46%(44/74)(u=4.860，P=0.001)。見圖2。

圖1 兩組患者無進展生存曲線圖

圖2 兩組患者總生存曲線圖

3 討 論

目前肺癌已經成為我國居民死亡的重要因素，其中肺腺癌是最為常見的類型?；煘榇瞬〉闹饕委熓侄危S著化療藥物應用時間的延長，腫瘤細胞會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，再次接受該化療藥物時效果甚微[7]。臨床研究顯示，肺腺癌患者多存在EGFR酪氨酸激酶結構域突變，雖然多數(shù)EGFR基因突變患者對吉非替尼等EGFR-TKI敏感，但存在不同程度的耐藥現(xiàn)象[8]。目前肺腺癌患者的吉非替尼耐藥率明顯升高，這嚴重影響患者的預后[9]。因此尋找有效地延長吉非替尼耐藥患者生存期、改善預后的藥物具有重要的意義。

對吉非替尼耐藥肺腺癌患者，臨床上多采用化療藥物治療，培美曲塞+卡鉑化療方案屬于較為常見的方案之一。其中培美曲塞是一種新型的多靶點葉酸拮抗劑，其可同時阻斷二氫葉酸還原酶、胸苷酸合成酶、甘氨酸核糖核苷甲?；D移酶等多種與葉酸相關的酶，從而阻礙腫瘤細胞的嘧啶和嘌呤合成，最終抑制腫瘤細胞的RNA和DNA合成，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[10-12]。阿法替尼是一種不可逆的EGFR-TKI，其可用于治療伴有EGFR外顯子19缺失或者外顯子21替代突變的晚期肺癌患者[13]。臨床研究顯示，阿法替尼可分別與EGFR上的殘基半胱氨酸(cysteine,Cys)797、Erb-B2受體酪氨酸激酶4上的Cys803、Erb-B2受體酶氨酸激酶2上的Cys805以共價的形式相結合，抑制酪氨酸激酶活性，進而導致細胞內酪氨酸殘基磷酸化，抑制信號轉導，因此其對EGFR突變的肺腺癌具有較強的抗腫瘤作用[14-16]。本研究結果顯示，治療后，與化療組患者相比，聯(lián)合組患者糖類抗原199、癌胚抗原、CYFRA21-1水平、Bcl-2 mRNA相對表達水平更低，Bax mRNA相對表達水平更高，臨床緩解率和2年存活率更高(P<0.05)，提示與單純培美曲塞+卡鉑化療方案相比較，阿法替尼聯(lián)合該方案治療吉非替尼耐藥肺腺癌，可更好地抑制腫瘤細胞增殖，降低腫瘤標志物的表達，改善患者預后。

長鏈非編碼RNA的轉錄本長度大于200 nt，其可經染色質修飾、轉錄激活、基因組印跡、X染色體的基因沉默、核內轉運等方式調控基因的表達，參與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展，且與患者預后具有一定的相關性[17-18]。目前已經證實SNHG12在多種惡性腫瘤組織(包括肺腺癌組織)中呈高表達，且與患者對多種藥物的反應密切相關，可作為此類患者發(fā)生多重耐藥后的治療靶點[19-20]。SNHG15屬于長鏈非編碼RNA家族中的一員，其可作為內源性競爭RNA，通過與微小RNA結合來促進惡性腫瘤的進展[21]。臨床研究顯示，SNHG15在肺腺癌中呈高表達，可作為肺腺癌的生物標志物[22]。SNHG16可誘導多種惡性腫瘤細胞的產生，是惡性腫瘤的促癌因子，其在肺腺癌組織中高表達，且與患者的化療耐藥、臨床特征密切相關，SNHG16表達量越高患者生存期越短[23-24]。本研究結果顯示，治療后聯(lián)合組患者的SNHG12、SNHG15、SNHG16相對表達水平較治療前降低，且低于化療組(均P<0.05)，提示阿法替尼聯(lián)合培美曲塞+卡鉑化療可能通過抑制SNHG12、SNHG15、SNHG16表達，發(fā)揮抑制腫瘤進展、改善患者預后、延長生存期的作用。

本研究結果還顯示，采用阿法替尼聯(lián)合培美曲塞+卡鉑化療方案治療的患者臨床緩解率和2年存活率升高，中位無進展生存期和中位總生存期延長，提示該方案可提高臨床療效，延長患者生存期。采用阿法替尼聯(lián)合培美曲塞、卡帕化療方案治療的患者的毒副反應發(fā)生率相對于采用單純培美曲塞+卡帕化療方案治療的患者更高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明采用阿法替尼聯(lián)合培美曲塞、卡帕化療方案治療具有較好的安全性。

綜上所述，與單純培美曲塞+卡鉑化療方案相比，阿法替尼聯(lián)合該方案治療吉非替尼耐藥肺腺癌，可更有效地抑制腫瘤細胞增殖，下調SNHG12、SNHG15、SNHG16表達，從而抑制腫瘤進展，提高臨床療效，延長患者生存期。