李 晶 趙 靜 孟德峰

1.開灤總醫(yī)院肝膽外科 (河北 唐山， 063000) 2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院

肝癌的主要病因是由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酗酒或血色素沉著病等引起的慢性肝臟腫瘤性疾病[1]。現(xiàn)階段，僅可為大約1/3的肝癌患者提供諸如肝切除術(shù)和肝移植之類的治療程序，并且患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率低[2]。因此，闡明肝癌進(jìn)展的潛在機(jī)制，以便開發(fā)出可有效對抗肝癌的治療藥物至關(guān)重要。阿法替尼是表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，被批準(zhǔn)用于一線治療患有EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌[3]。研究表明，阿法替尼單用或與Mithramycin A聯(lián)合使用對肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，對細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用[4]。然而其對肝癌Hep3B細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響與機(jī)制目前還未有報(bào)道。早期生長反應(yīng)因子1 (Egr1)/Toll樣受體4(TLR4)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與腫瘤進(jìn)展，與癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)過程密切相關(guān)[5]。本研究以肝癌Hep3B細(xì)胞為對象，研究阿法替尼在細(xì)胞增殖、遷移侵襲、凋亡中的功能，并結(jié)合Egr-1/TLR4/mTOR信號通路，探索其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肝癌細(xì)胞系Hep3B購自廣州Cellcook Cell Biotechnology，阿法替尼購自美國Selleck，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)購自美國HyClone，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco，青霉素/鏈霉素、RIPA緩沖液、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自上海Beyotime生物技術(shù)研究所，Egr-1過表達(dá)載體pcDNA-Egr-1、空載對照pcDNA-con購自上海吉瑪，RIPA緩沖液購自美國Sigma-Aldrich，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的(Cleaved)-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、Egr-1、TLR4、mTOR抗體購自英國Abcam，基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 肝癌細(xì)胞Hep3B在DMEM培養(yǎng)基(包含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素)和37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的Hep3B細(xì)胞分為NC組(未處理)，0.5 μmol/L 阿法替尼組(0.5 μmol/L 阿法替尼處理細(xì)胞48 h)，1.0 μmol/L 阿法替尼組(1.0 μmol/L 阿法替尼處理細(xì)胞48 h)，2.0 μmol/L 阿法替尼組(2.0 μmol/L 阿法替尼處理細(xì)胞48 h)，4.0 μmol/L 阿法替尼組(4.0 μmol/L 阿法替尼處理細(xì)胞48 h)，阿法替尼+pcDNA-con組(轉(zhuǎn)染pcDNA-con并用2.0 μmol/L 阿法替尼處理細(xì)胞48 h)，阿法替尼+ pcDNA-Egr-1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-Egr-1并用2.0 μmol/L 阿法替尼處理細(xì)胞48 h)。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用Lipofectamine?2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，即將3×105個(gè)/孔細(xì)胞接種在6孔板上，并用pcDNA-Egr-1或pcDNA-con轉(zhuǎn)染匯合度為70%～80%的Hep3B細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后， 用2.0 μmol/L 阿法替尼進(jìn)行處理。

1.3 免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9、Egr-1、TLR4、mTOR蛋白的表達(dá) 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解總蛋白。離心(12 000 g，5 min)后，用Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以分離等量的蛋白，將其印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在4℃與一抗孵育過夜。一抗如下所示：抗CyclinD1(1∶1 000)，抗Cleaved-caspase-3(1∶1 000)，抗MMP2(1∶1 000)，抗MMP9(1∶1 000)，抗Egr-1(1∶1 000)，抗TLR4(1∶1 000)和抗mTOR(1∶1 000)。將PVDF膜與二抗(辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔)孵育2 h。最后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測印跡。以β肌動蛋白(β-actin)為參照，分析蛋白的表達(dá)。

1.4 噻唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞增殖 Hep3B細(xì)胞接種于96孔中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，48 h后，將MTT(終濃度為5 mg/ml)加入到每個(gè)孔中，并在37℃下孵育2 h。將DMEM培養(yǎng)基更換為100 μl二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下孵育，結(jié)晶溶解后在酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度OD。

1.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 為了檢測Hep3B細(xì)胞凋亡，將5 μl磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶添加到細(xì)胞中，然后在室溫下孵育20 min。用流式細(xì)胞儀評估細(xì)胞凋亡，并用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移侵襲 Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲能力通過24孔Transwell小室評估。以1∶10稀釋的基質(zhì)膠包被上腔室用于侵襲分析，未涂覆基質(zhì)膠用于遷移分析。將3×104個(gè)Hep3B細(xì)胞重懸于100 μl無血清DMEM中，并接種于上腔室，而底部腔室裝有800 μl補(bǔ)充10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后，用棉簽擦拭未遷移/未侵襲的細(xì)胞，并將遷移/侵襲細(xì)胞在室溫下用4%聚甲醛固定5 min，并用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min。在光學(xué)顯微鏡下，對隨機(jī)選擇的3個(gè)區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿法替尼對Hep3B細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示，0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L阿法替尼組Hep3B細(xì)胞的增殖活性和CyclinD1蛋白含量均顯著低于NC組(P<0.05)。見圖1。

與NC組比較，*P<0.05

2.2 阿法替尼對Hep3B細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果表明，0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L 阿法替尼組Hep3B細(xì)胞的凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白含量均顯著高于NC組(P<0.05)。結(jié)合2.1結(jié)果，選擇差異最顯著的2.0 μmol/L 阿法替尼展開后續(xù)研究。見圖2。

與NC比較，*P<0.05

2.3 阿法替尼對Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲的影響 結(jié)果表明，與NC組比較，2.0 μmol/L 阿法替尼組顯著減少細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量，并顯著降低Hep3B細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)(P<0.05)。見圖3。

注：與NC比較，*P<0.05

2.4 阿法替尼對Egr-1/TLR4/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與NC組比較，2.0 μmol/L 阿法替尼組顯著降低Hep3B細(xì)胞中Egr-1、TLR4、mTOR蛋白的含量(P<0.05)。見圖4。

注：與NC比較，*P<0.05

2.5 pcDNA-Egr-1可以逆轉(zhuǎn)阿法替尼對Hep3B細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 結(jié)果表明，與阿法替尼+pcDNA-con組比較，阿法替尼+pcDNA-Egr-1組Hep3B細(xì)胞的增殖活性提高，凋亡率減少，細(xì)胞遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量增加，并且CyclinD1蛋白含量升高，Cleaved-caspase-3含量降低，MMP2、MMP9、Egr-1、TLR4、mTOR蛋白含量升高(P<0.05)。見圖5。

注：與阿法替尼+pcDNA-con比較，*P<0.05

3 討論

肝癌是醫(yī)學(xué)上的最大挑戰(zhàn)之一，其特征是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和手術(shù)后復(fù)發(fā)，預(yù)后差、存活率低[6]。因此，有必要闡明肝癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的分子機(jī)制，并確定肝癌的新治療策略。本研究評價(jià)阿法替尼對人肝癌Hep3B細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及可能的作用機(jī)制。結(jié)果表明，阿法替尼抑制了肝癌Hep3B細(xì)胞的增殖、遷移侵襲，和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管尚不清楚阿法替尼介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長抑制和凋亡促進(jìn)的詳細(xì)機(jī)制，但從本研究中發(fā)現(xiàn)以下機(jī)制：阿法替尼抑制Egr-1/TLR4/mTOR信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)揮腫瘤抑制功能。

作為第二代EGFR TKI，阿法替尼是一種口服不可逆的ErbB家族阻滯劑，可選擇性有效地阻斷所有相關(guān)ErbB家族受體(ErbB1，ErbB2和ErbB4)的信號傳導(dǎo)[7]。除了非小細(xì)胞肺癌，阿法替尼逐漸成為多種腫瘤的潛在治療選擇，如卵巢癌[8]、肺鱗狀細(xì)胞癌[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]等。根據(jù)報(bào)道，在肝癌HepG2細(xì)胞中，阿法替尼可降低CyclinD1和提高caspase-3表達(dá)，起著抗增殖和促凋亡的作用[4]。阿法替尼不僅能有效抑制肝癌Huh-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而且還能通過抑制表皮生長因子受體來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平，這種抑制作用與ERK-VEGF/MMP9信號通路有關(guān)[12]。骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)阿法替尼治療后，細(xì)胞活性受到抑制，以及遷移性和侵襲性降低，機(jī)制與降低ErbB信號通路活性有關(guān)[13]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，阿法替尼通過抑制EGFR下游途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用，并在G1誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[14]。本研究的MTT、流式細(xì)胞儀、Transwell等數(shù)據(jù)顯示，阿法替尼顯著降低肝癌Hep3B細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞遷移及侵襲能力，并顯著提高細(xì)胞的凋亡率。此外，阿法替尼還可降低增殖相關(guān)蛋白CyclinD1、遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9的表達(dá)，而提高凋亡執(zhí)行凋亡Cleaved-caspase-3的表達(dá)，這些發(fā)現(xiàn)證明了阿法替尼在治療肝癌方面的潛力，與既往研究報(bào)道一致[4,11]。

在本研究中，阿法替尼顯著降低肝癌Hep3B細(xì)胞的Egr-1、TLR4、mTOR蛋白含量，提示阿法替尼抗肝癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、促凋亡的功能可能與Egr-1/TLR4/mTOR信號通路有關(guān)。Egr-1/TLR4/mTOR信號通路此前已被報(bào)道與癌癥進(jìn)展有關(guān)。抑制Egr1的表達(dá)降低了TLR4/mTOR和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[15]，還可減慢肝癌HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖[16]。下調(diào)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的TLR4后，肝癌Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱[17]。為了進(jìn)一步探討阿法替尼抑癌機(jī)制，本研究在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Egr-1過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Egr-1，上調(diào)其表達(dá)。結(jié)果顯示，Egr-1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了阿法替尼對Hep3B細(xì)胞增殖、遷移侵襲、Egr-1/TLR4/mTOR信號通路的抑制作用，和對Hep3B細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，此外，阿法替尼降低CyclinD1、MMP2、MMP9表達(dá)及提高Cleaved-caspase-3表達(dá)的作用也被逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，Egr-1/TLR4/mTOR信號通路是阿法替尼影響肝癌Hep3B細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的重要途徑之一。

本研究結(jié)果表明，阿法替尼可能作為一種有效的肝癌治療劑，通過抑制Egr-1/TLR4/mTOR信號通路活性，抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖、遷移侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為肝癌臨床實(shí)踐提供了一個(gè)潛在的治療選擇。