左亞鋒 王娜 王孟虎 湯建 吳德玲 張偉

摘 要：目的：研究亳菊模擬加工過程中關(guān)鍵酶活性變化對黃酮類成分的影響以及兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。方法：采用pNPG法測定不同溫度溫度下不同時間點加工的亳菊樣品中酶活性;同時采用HPLC測定40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃ 6個溫度不同時間點加工的亳菊樣品中6種黃酮類成分的含量。通過酶活性大小測定和化學(xué)成分含量變化來研究兩者之間的相關(guān)性及加工溫度對亳菊質(zhì)量的內(nèi)在影響。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)亳菊細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活性在低溫下（<80℃）保存時間較長，在高溫狀態(tài)下（≥80℃），酶活性下降較快，90℃下酶在15min內(nèi)基本失活。同時我們發(fā)現(xiàn)亳菊中黃酮苷類成分在不同溫度下隨著加熱時間延長，黃酮苷類成分含量變化跟酶活性有密切的相關(guān)性。當新鮮亳菊在低溫下（<80℃）加熱時，關(guān)鍵酶酶活性在亳菊細胞內(nèi)保存時間較長，酶活性越高，黃酮苷類成分降低越明顯，隨著時間增加，酶活性在細胞內(nèi)穩(wěn)定性降低但仍有酶活性，黃酮苷類成分逐漸降低;當新鮮亳菊在高溫下加熱時，由于溫度在新鮮亳菊內(nèi)是漸進式增大的，細胞體內(nèi)酶活性在15min內(nèi)基本都有活性，所以在15min內(nèi)黃酮苷類成分是逐漸降低，隨著加熱時間增加，細胞體內(nèi)達到高溫狀態(tài)，酶逐漸失活，無法水解黃酮苷類成分，黃酮苷類成分保持穩(wěn)定。在實驗過程中，黃酮苷元（金合歡素）含量升高，木犀草素含量升高不顯著，芹菜素含量降低。結(jié)論：亳菊中黃酮類化合物含量變化和亳菊細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活性變化有密切的相關(guān)性，通過調(diào)控亳菊加工過程中的溫度可以影響亳菊細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活性進而影響其黃酮類成分含量的變化。而黃酮苷元（金合歡素）含量升高，木犀草素含量升高不明顯，芹菜素含量降低，推測是因其結(jié)構(gòu)性質(zhì)易形成配合物及加熱激活褐變酶的酶活性使其氧化聚合而含量降低，其反應(yīng)機理有待進一步驗證。通過實驗研究，我們確定了溫度對酶活性和黃酮類成分的影響及其相關(guān)性，這為我們規(guī)范亳菊加工，保障亳菊品質(zhì)提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：亳菊;酶活性;干燥;相關(guān)性;黃酮類成分

中圖分類號：O656.4? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2022）02-0068-04

菊花為菊科植物菊的干燥頭狀花序[1]，藥典收載的五種藥用菊花因產(chǎn)地和加工方法的不同分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”“懷菊”。五種藥用菊花加工方式差異較大，其中亳菊的傳統(tǒng)加工方式為陰干[2]，但是隨著市場對亳菊需求量的增加，這種傳統(tǒng)方式已經(jīng)無法適應(yīng)產(chǎn)地大規(guī)模生產(chǎn)需求，市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)亳菊目前產(chǎn)地加工主要方式為烘干。相關(guān)文獻報道發(fā)現(xiàn)，不同加工方式的亳菊中化學(xué)成分含量差異較大，這其內(nèi)在品質(zhì)會有一定影響[3-6]，課題組前期研究[7-9]表明亳菊在加工過程中黃酮類成分含量變化主要機理就是加熱激活亳菊細胞內(nèi)關(guān)鍵酶酶活性，酶水解黃酮苷生成黃酮苷元從而對亳菊品質(zhì)產(chǎn)生影響。但是溫度如何影響酶活性以及酶活性和黃酮類成分之間的相關(guān)性并沒有見報道，因此本文對亳菊模擬加工過程中溫度對酶活性和黃酮類成分的影響及其相關(guān)性進行研究，期待為新鮮亳菊產(chǎn)后規(guī)范加工提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

Waters1525型高效液相色譜系統(tǒng)（廠家）;XS3DU分析天平（廠家梅特勒-托利多）;FA2104N電子天平（上海菁海儀器有限公司）;DGT-G70電熱鼓風恒溫干燥箱（合肥華德利科學(xué)器材有限公司）;JK-250DB型數(shù)控超聲清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）;Heraeus Multifuge X1R低溫離心機（美國賽默飛公司）;85-2控溫磁力攪拌器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）;UV-759CRT紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（合肥博美生物科技有限公司）;檸檬酸，檸檬酸銨，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，石英砂均購自天津永大化學(xué)試劑有限公司;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號CFN98565，純度≥98%）;木犀草素對照品（批號CFN98784，純度≥98%）;芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號CFN98981，純度≥98%）均購自武漢天植生物有限公司;芹菜素對照品（111901-201603，純度99.2%）;綠原酸對照品（110753-201817，純度96.8%）;3，5-二咖啡?？鼘幩幔?11782-201807，純度94.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院;金合歡素（自制，歸一化度≥98%）;金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷（自制，歸一化度≥98%）。亳菊：采自亳州亳菊藥材基地，由閆攀鑒定為菊科植物亳菊Dendranthema morifolium（Ramat.） Tzvel.‘Boju’cv.nov.的頭狀花序。磷酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司，分析純）;甲醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，分析純）;乙腈（邁達科技股份有限公司，色譜純）;水為純凈水。

2 方法

2.1 亳菊模擬加熱樣品制備

取新鮮亳菊5g，精密稱定，放入托盤中，置于不同溫度的干燥箱中模擬加熱，設(shè)定40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃六個溫度點，分別在1min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120 min、240min、360min時取樣。

2.2 關(guān)鍵酶活性測定[7，8]

2.2.1 關(guān)鍵酶提取

取不同溫度不同時間點下加熱的亳菊，置于榨汁機中，加入少量石英沙和5%的甘油，再加入適量預(yù)冷的100mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.0），榨汁1min成勻漿后于低溫下緩慢攪拌1h后抽濾。抽濾液轉(zhuǎn)移到離心管中，放置于低溫冷凍離心機中，12000r/min離心20min，取上清液作為粗酶液。

2.2.2 關(guān)鍵酶酶活性測定

在試管中加入0.2mL pNPG，0.6mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH4.0）和0.2mL酶液，在50℃水浴條件下反應(yīng)45min。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入2.5mL 1mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，在400nm波長下測定其吸光度值。

2.3 含量測定[6]

2.3.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷⒛鞠菟?7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金合歡素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和芹菜素適量至5mL容量瓶中，用70%甲醇定容，制成每毫升含有綠原酸1.02mg、3，5-二咖啡?？鼘幩?.236mg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.752mg、木犀草素1.052mg、金合歡-7-O-β-D-葡萄糖苷0.608mg、金合歡素1.062mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷1.102mg和芹菜素1.032mg的對照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 供試液的制備

取不同溫度和時間下加熱亳菊鮮花約5g，精密稱定，精密加入70%甲醇50mL至具塞錐形瓶，稱定重量，超聲處理（功率500W，頻率45kHz），40min，放冷，再稱定重量，用70%的甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.3 HPLC條件

Agilent HC-C18（2）柱（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），線性梯度洗脫（0～8min，12%～17%A;8～25min，17%～19%A;25～30min，19%～19%A;30～60min，19%～52%A;60～65min，52%～12%A）;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為330nm，進樣體積20μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 新鮮亳菊加工過程中關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律

由圖1可知，關(guān)鍵酶在亳菊細胞內(nèi)熱穩(wěn)定性較好，亳菊在40℃及50℃狀態(tài)下加熱2h，關(guān)鍵酶酶活性仍很高，加熱超過6h才基本失去活性。隨溫度升高酶穩(wěn)定性逐漸下降，當加熱溫度為60℃時，加熱2h酶活性就很微弱，當加熱溫度超過70℃時，酶活性會急劇下降，加熱45min基本失活。在溫度為90℃時，酶在10min內(nèi)即基本失活。

本實驗研究的是亳菊細胞內(nèi)關(guān)鍵酶熱穩(wěn)定性，與課題組前期研究[6，8]提取純化得到的亳菊酶液進行的性質(zhì)研究相比較，得到的規(guī)律基本相同。這說明關(guān)鍵酶在復(fù)雜的細胞內(nèi)體系中和單一的細胞外體系內(nèi)性質(zhì)差別不大，將該酶純化后進行性質(zhì)研究所得的結(jié)果可以適用于原藥材的復(fù)雜體系內(nèi)。

3.2 新鮮亳菊模擬加工過程中主要成份含量變化規(guī)律

由圖2-4可知，加熱溫度對亳菊黃酮類成分影響較大。通過比較發(fā)現(xiàn)，在低溫狀態(tài)下，酶活性較大，酶活性保存時間較長。隨著加熱時間增加，酶活性穩(wěn)定性逐漸降低但仍有酶活性。在此期間對應(yīng)的黃酮苷類成分因關(guān)鍵酶的水解逐漸降低直至消失。在高溫狀態(tài)下，由于溫度在亳菊細胞內(nèi)是漸進式升高，酶活性并沒有直接被滅活，15min內(nèi)保持基本酶活性，在此期間黃酮苷類成分是逐漸降低的。高溫狀態(tài)下隨著加熱時間增長，亳菊細胞內(nèi)也達到高溫狀態(tài)，關(guān)鍵酶酶活性基本消失，此后時間段黃酮苷類成分基本保持穩(wěn)定。由圖2-4也可知，亳菊干燥狀態(tài)下（干燥2h，4h，6h），黃酮苷類成分含量在高溫狀態(tài)下要比低溫狀態(tài)下高，這是因亳菊干燥2h，4h，6h后，高溫滅活關(guān)鍵酶酶活性，使其不能水解黃酮苷生成黃酮苷元。但是黃酮苷元中木犀草素和芹菜素的含量隨著加熱時間的延長并沒有顯著的升高，這可能跟其結(jié)構(gòu)性質(zhì)及亳菊中存在的褐變酶有一定關(guān)系。亳菊中的褐變酶主要有多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等，這些酶的存在會作用于亳菊中的酚類、黃酮類成分，使其發(fā)生氧化和聚合反應(yīng)導(dǎo)致組織褐變，甚至腐敗變質(zhì)，嚴重影響亳菊品質(zhì)和質(zhì)量[10]。目前國內(nèi)有學(xué)者對亳菊褐變酶[11]和硫熏劑量對亳菊褐變酶和化學(xué)成分的影響[12]進行了報道，結(jié)果表明亳菊采收加工中酚類等成分變化的主要因素可能就是褐變酶被激活。因此我們推測亳菊加熱過程中在低溫狀態(tài)下褐變酶被激活，這兩種黃酮苷元被褐變酶氧化聚合而含量降低。當溫度升高時，由于褐變酶在新鮮亳菊組織體內(nèi)，而溫度升高在新鮮亳菊組織內(nèi)部是漸進式的，這就導(dǎo)致褐變酶在高溫狀態(tài)下是先被激活后被抑制，仍然會產(chǎn)生作用。黃酮類化合物大多數(shù)為強的金屬螯合劑[13]，熊運浩[14]對木犀草素-金屬配合物的制備進行了研究，并在中藥水煎液中發(fā)現(xiàn)木犀草素與金屬微量元素形成的配合物，蔡勝[15]，楚婧[16]，丁桂峰[17]，夏小明[18]等分別對木犀草素-金屬配合物的制備進行了研究，孫秀琴等[19]綜述了芹菜素和鐵、芹菜素和銅的螯合作用，結(jié)果表明木犀草素、芹菜素與金屬離子有較強的配位能力，木犀草素、芹菜素與金屬離子形式配合物也是影響其含量的一種因素。

4 討論

亳菊在加工過程中溫度的選擇會對亳菊質(zhì)量產(chǎn)生很大影響。亳菊中由于存在關(guān)鍵酶，在一定溫度下會激活關(guān)鍵酶水解黃酮產(chǎn)生黃酮苷元。加工過程中溫度不同，導(dǎo)致關(guān)鍵酶活性不同，從對酶水解黃酮產(chǎn)生黃酮苷元影響，最終加工得到的亳菊品質(zhì)差異很大。因此，在亳菊規(guī)范加工過程中應(yīng)充分考慮溫度對關(guān)鍵酶活性和黃酮類成分的影響，根據(jù)其相關(guān)性選擇合適溫度的加工方法。亳菊中也存在褐變酶，推測該酶在加工過程中由于溫度的影響也會對黃酮苷元含量產(chǎn)生影響，具體影響及其基質(zhì)還需要我們進一步研究。因此，在亳菊的加工過程中不僅要考慮到溫度變化對關(guān)鍵酶的影響，也要考慮亳菊中存在的褐變酶，規(guī)范亳菊加工工藝，保證亳菊質(zhì)量。

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收稿日期：2021-09-27

通訊作者：張偉（1985-），男（漢族），碩士，副教授，研究方向：中藥炮制及中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81973485）;國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81303229）;安徽高校自然科學(xué)研究重點項目（KJ2020A0765）;中藥原料產(chǎn)品研發(fā)安徽普通高校重點實驗室（亳州學(xué)院）（KLAHEI18032）;亳州學(xué)院校級科研項目（BY2017C04）

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