吳 宇 方旭波,2,* 陳小娥,3,* 劉政捷 袁高峰 余 輝 楊會(huì)成

(1 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2 浙江國(guó)際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 舟山 316021； 3舟山市海大科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 舟山 316000；4浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山 316021)

遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)(Sardinopssagax)是一種分布廣、資源量大的中上層遠(yuǎn)洋魚(yú)類，富含ω-3多不飽和脂肪酸及蛋白質(zhì)。由于其個(gè)體小、含脂量高，且魚(yú)腥味較重、刺較多，70%的沙丁魚(yú)被加工為魚(yú)粉飼料[1]。酶法水解是一種有效利用魚(yú)類蛋白資源的途徑，然而水解物通常魚(yú)腥味重，某種程度上限制了其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。目前采用微生物發(fā)酵是改善魚(yú)蛋白酶解液風(fēng)味品質(zhì)的有效途徑之一。朱文慧等[3]采用耐鹽酵母對(duì)鱈魚(yú)骨酶解液進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后酶解液中香氣活性化合物和鮮味氨基酸的含量明顯增加，風(fēng)味品質(zhì)得到顯著改善。段旭昌等[4]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可賦予甲魚(yú)酶解液特殊的發(fā)酵香味，改善其整體風(fēng)味品質(zhì)。因此，通過(guò)微生物發(fā)酵不僅可以賦予產(chǎn)物獨(dú)特的風(fēng)味，消除魚(yú)蛋白酶解液的魚(yú)腥味，還能夠改善產(chǎn)物的品質(zhì)，為后續(xù)開(kāi)發(fā)新型海鮮調(diào)味料提供研究基礎(chǔ)。

電子鼻技術(shù)具有快速便捷、結(jié)果客觀、不損壞樣品等特點(diǎn)，近年來(lái)在水產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)鑒定中應(yīng)用廣泛[5]。電子鼻內(nèi)置軟件可對(duì)樣本進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)，通過(guò)主成分空間上樣本點(diǎn)的距離來(lái)分辨風(fēng)味的差異[6]?？荡浯涞萚7]研究發(fā)現(xiàn)，使用電子鼻PCA分析可以有效區(qū)分不同溫度條件下花鱸魚(yú)肉風(fēng)味的差異。與其他風(fēng)味鑒定和表征技術(shù)相比，氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)是一種檢測(cè)揮發(fā)性化合物的新型聯(lián)用技術(shù)，其分離能力更強(qiáng)，也避免了復(fù)雜耗時(shí)、碎片離子解譜困難等問(wèn)題，目前被廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析[8]。龐一揚(yáng)等[9]利用GC-IMS對(duì)腌魚(yú)腌制過(guò)程中揮發(fā)性成分的變化進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，腌制后魚(yú)肉中氮氧類、醛酮類、酯類和甲基類化合物種類和含量均增加。

本研究以遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)蛋白酶解液為原料，以浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離篩選的長(zhǎng)孢洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)[10]進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)電子鼻PCA技術(shù)判別不同發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度以及pH值等條件下發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味的差異，并以氨基酸態(tài)氮含量結(jié)合感官評(píng)價(jià)優(yōu)化該發(fā)酵條件，獲得發(fā)酵產(chǎn)物后進(jìn)行游離氨基酸組成分析和必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)；采用GC-IMS技術(shù)分析酶解液發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為沙丁魚(yú)酶解液的后續(xù)加工利用提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)，舟山市海利遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司，平均體長(zhǎng)15～18 cm，-20℃冰箱冷凍保存；動(dòng)物蛋白水解酶(1×105U·g-1)，南寧龐博生物工程有限公司；長(zhǎng)孢洛德酵母，由浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用超低溫冰箱于-80℃保存；鹽酸、甲醛等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2組織搗碎機(jī)，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；SHA-C往復(fù)式水浴恒溫震蕩器、HH-6電熱恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；BXH-65電熱鼓風(fēng)干燥箱、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-16C低速大容量離心機(jī)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠；YXQ-LS-50G壓力蒸汽滅菌器，上海科曉科學(xué)儀器有限公司；PEN 3電子鼻便攜式系統(tǒng)，德國(guó) Airsense公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；Flavour Spec?風(fēng)味分析儀，德國(guó)GAS公司。

1.3 蛋白酶解液的制備

參照馬小燕等[11]的方法并略作修改。使用流水解凍的方式解凍遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)，切碎后均質(zhì)。按照料液比1∶4(w/v)、動(dòng)物蛋白水解酶添加量4 000 U·g-1、自然pH將樣品置于50℃水浴恒溫振蕩器中酶解6.5 h。反應(yīng)結(jié)束后置于沸水浴中20 min，冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，置于4℃冰箱冷藏備用。

1.4 長(zhǎng)孢洛德酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn) 量取200 mL遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)蛋白酶解液，按酶解液體積分?jǐn)?shù)的0.1%向其中接種長(zhǎng)孢洛德酵母菌液，以氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分值為指標(biāo)，以電子鼻檢測(cè)結(jié)果輔助分析，研究發(fā)酵時(shí)間(0、6、12、18、24 d)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35、40℃)、酶解液pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)3個(gè)單因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味品質(zhì)的影響，固定條件設(shè)定發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為12 d、酶解液pH值為5.0，每組各做3次平行試驗(yàn)，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味進(jìn)行電子鼻分析。

1.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分為指標(biāo)，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and levels used for orthogonal text

1.5 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定參照王琳等[12]方法，采用甲醛滴定法測(cè)定。

1.6 電子鼻分析

電子鼻參數(shù)設(shè)置參考鄺格靈等[13]的方法，將15 mL發(fā)酵液置于50 mL燒杯中，用保鮮膜封閉15 min后進(jìn)行電子鼻檢測(cè)。測(cè)定時(shí)間為98 s，載氣流速和進(jìn)樣流量均設(shè)置為200 mL·min-1。以未經(jīng)發(fā)酵的酶解液為對(duì)照組，通過(guò)PEN3電子鼻的WinMuster軟件對(duì)采集到的樣品氣味信息進(jìn)行主成分分析。

1.7 感官評(píng)價(jià)

發(fā)酵產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)參照陳曉婷等[14]的方法并略作修改，采用描述性定量分析法(quantitative descriptive analysis test)進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)《GB/T 16291.1-2012感官分析選拔與培訓(xùn)感官分析優(yōu)選評(píng)價(jià)員導(dǎo)則》[15]中所述的感官分析優(yōu)選評(píng)價(jià)員的選拔與培訓(xùn)方法，篩選由10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的食品專業(yè)研究生組成感官評(píng)價(jià)小組。每組發(fā)酵液分別量取50 mL置于3個(gè)250 mL錐形瓶中并隨機(jī)編號(hào)，用保鮮膜密封后置于60℃恒溫水浴10 min。采用先聞后嘗的方式，測(cè)試過(guò)程中不允許交流討論。根據(jù)表2評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[16-17]對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特性進(jìn)行獨(dú)立評(píng)價(jià)打分，每項(xiàng)滿分10分，總分40分，分值越大，說(shuō)明發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味越好，剔除異常數(shù)再取平均值為最終結(jié)果。

表2 發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味感官標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of flavour of fermentation product

1.8 游離氨基酸的測(cè)定及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

游離氨基酸的測(cè)定參照Yang等[18]的方法并略作修改，將采用優(yōu)化后工藝制得的發(fā)酵液與未經(jīng)發(fā)酵的酶解液的樣品于5 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清，分別用一次性注射器吸取3 mL樣液于20 mL水解管中，加入10 mL濃度為6 mol·L-1的鹽酸溶液，密封，在110℃恒溫干燥箱中保溫水解24 h，水解完成后于8 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm水性膜過(guò)濾后，放入氨基酸自動(dòng)分析儀樣品盒中，上機(jī)測(cè)定。并參照周仁客等[19]的方法計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸評(píng)分(amino acids score，AAS)、化學(xué)評(píng)分(chemical score，CS)及必需氨基酸指數(shù)(essential amino acids index，EAAI)。

1.9 GC-IMS分析酶解液發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味動(dòng)態(tài)變化

采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過(guò)程中每隔6 d取樣(0、6、12和18 d)，將同樣放置18 d的酶解液作為對(duì)照組，使用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀對(duì)這5組樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。參照Li等[20]的方法并略作修改。分別量取1 mL發(fā)酵液于20 mL的頂空瓶中密封。隨后，將樣品在40℃下孵育20 min，孵化轉(zhuǎn)速為500 r·min-1。采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣的方式使用85℃的進(jìn)樣針將500 μL樣品注入進(jìn)樣器。

1.9.1 GC條件 色譜柱類型：FS-SE-54-CB-1型(15 m ID:0.53 mm)；載氣：高純N2(純度 ≥ 99.999%)；柱溫：60℃；分析時(shí)間：30 min；載氣起始流度為2 mL·min-1，保持2 min，在2～10 min內(nèi)上升至10 mL·min-1，10～20 min內(nèi)線性上升至100 mL·min-1，20～30 min內(nèi)上升至150 mL·min-1。

1.9.2 IMS條件 電離源：β 射線(氚3H)，漂移氣為高純N2(純度 ≥ 99.999%)，溫度45℃，流速150 mL·min-1，正離子模式。

1.10 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Origin Pro 8.5軟件繪圖，使用SPSS 18.0軟件Duncan氏法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，電子鼻及GC-IMS數(shù)據(jù)采用軟件自帶程序進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)蛋白酶解液發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味與品質(zhì)的影響 由圖1可知，隨著發(fā)酵的持續(xù)，沙丁魚(yú)蛋白酶發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量不斷增加，從12 d開(kāi)始增速減小，18 d后趨于平緩。此外，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為12 d時(shí)，發(fā)酵液的感官評(píng)分最高，風(fēng)味最好。由圖2可知，不同發(fā)酵時(shí)間下主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為95.21%和3.93%，總貢獻(xiàn)率為99.14%。各處理組間無(wú)重疊，說(shuō)明電子鼻PCA可以獲得較好的區(qū)分效果，這與朱丹實(shí)等[21]的研究結(jié)果類似。發(fā)酵12、18和24 d的發(fā)酵產(chǎn)物在主成分空間上呈線性排列，18 d的發(fā)酵產(chǎn)物在PC1上與0 d距離最近，24 d時(shí)在PC2上最低。綜上，長(zhǎng)孢洛德酵母發(fā)酵酶解液的適宜發(fā)酵時(shí)間為12 d。

注：不同大寫字母表示氨基酸態(tài)氮含量差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示感官評(píng)分值差異顯著(P<0.05)。下同。Note: DifferenTCapital letters mean significant difference in content of amino acid nitrogen at 0. 05 level, different lowercase letters mean significant difference in score of sensory evaluation at 0. 05 level. The same as following.圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量及感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the content of amino acid nitrogen and score of sensory evaluation in fermentation product

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)物的PCA圖Fig.2 PCA diagram of fermentation product at different fermentation time

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味與品質(zhì)的影響 由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮的含量呈先上升后略微下降的趨勢(shì)，在35℃時(shí)氨基酸態(tài)氮含量最高。此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物的感官評(píng)分也最高，風(fēng)味更易被接受。由圖4可知，不同發(fā)酵溫度下PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為89.37%和10.16%，總貢獻(xiàn)率為99.53%。各樣品之間無(wú)重疊，說(shuō)明電子鼻PCA可以很好地將其區(qū)分開(kāi)，這與鄭平安等[22]的研究結(jié)果類似。與未經(jīng)發(fā)酵的酶解液相比，各處理組在PC1上與其相差較大，說(shuō)明溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味有重要影響。而處理組間在PC1上相差較小，在PC2上相差較大。30、35 和40℃下的發(fā)酵產(chǎn)物在主成分空間中相對(duì)較集中，在PC2上的差距較小且高于其他兩組，35℃下的發(fā)酵產(chǎn)物在PC1上與對(duì)照組的差異高于30、40℃。綜上，長(zhǎng)孢洛德酵母發(fā)酵酶解液的適宜溫度為35℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量 及感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the content of amino acid nitrogen and score of sensory evaluation in fermentation product

圖4 不同發(fā)酵溫度發(fā)酵產(chǎn)物的PCA圖Fig.4 PCA diagram of fermentation product at different fermentation temperature

2.1.3 發(fā)酵環(huán)境pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味品質(zhì)的影響 由圖5可知，隨著發(fā)酵液pH值的升高，發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH值為5.0時(shí)其含量達(dá)到最高。且此pH值條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的感官評(píng)分最高，風(fēng)味相對(duì)較好。由圖6可知，不同pH值條件下發(fā)酵產(chǎn)物PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為92.18%和7.37%，總貢獻(xiàn)率為99.55%，說(shuō)明樣品所受干擾較小，PCA能夠較好地反映樣品信息，這與朱文慧等[23]的研究結(jié)果相似。與未經(jīng)發(fā)酵的酶解液相比，各試驗(yàn)組在PC2上與其相差較大，在PC1上差異較小，說(shuō)明pH對(duì)酶解液發(fā)酵有重要影響。pH值 4.5和 6.0在PC2上差異不明顯，與其他組差異較明顯，而pH值5.0組在PC2上最高。綜上，遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液發(fā)酵的適宜pH值為5.0。

2.1.4 產(chǎn)香酵母發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，就氨基酸態(tài)氮含量而言，各因素影響的順序?yàn)锳>C>B，即發(fā)酵時(shí)間>pH值>發(fā)酵溫度，對(duì)于感官評(píng)分值的影響也是如此。綜合以上3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響，得出長(zhǎng)孢洛德酵母發(fā)酵遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液的最佳條件為A2B3C2，即發(fā)酵時(shí)間12 d、發(fā)酵溫度40℃、pH值5.0。量取200 mL的酶解液，按其體積分?jǐn)?shù)的0.1%接種長(zhǎng)孢洛德酵母菌液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，于40℃下培養(yǎng)12 d，平行3次。結(jié)果表明，氨基酸態(tài)氮含量為8.417 mg·mL-1；發(fā)酵產(chǎn)物鮮香味濃郁，無(wú)腥異味和苦澀味，感官評(píng)分為36.749。其中感官評(píng)分值高于表3中的數(shù)據(jù)，說(shuō)明正交結(jié)果具有適用性和可靠性。

圖5 pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量及感官 評(píng)分值的影響Fig.5 Effect of pH value on the content of amino acid nitrogen and score of sensory evaluation in fermentation product

圖6 不同pH值下發(fā)酵液的PCA圖Fig.6 PCA diagram of fermentation product at different pH value

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

2.2 游離氨基酸組成分析及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

由表4可知，酶解液發(fā)酵前后游離氨基酸組成相同，共檢出16種游離氨基酸，但是其含量存在明顯差異。發(fā)酵前，酶解液中游離氨基酸的含量為3.886 g·100g-1， 而發(fā)酵后的產(chǎn)物中游離氨基酸總量為7.872 g·100g-1，增加了102.57%。各種氨基酸含量的增量均大于50%，其中增量最大的為Tyr(250.93%)，增量最小的為Ala(56.54%)。產(chǎn)物中必需氨基酸含量為3.082 g·100g-1， 鮮味氨基酸含量為3.727 g·100g-1。在游離氨基酸中，Glu含量最多，His含量最少。

表4 游離氨基酸組成分析Table 4 Analysis of free amino acid composition

由表5可知，當(dāng)遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)發(fā)酵產(chǎn)物以AAS為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Met評(píng)分最高，Lys評(píng)分最低。以CS為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，評(píng)分最高和最低的同樣是Met、Lys，因此Lys為第一限制性氨基酸。EAAI常用來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[24]，遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)發(fā)酵產(chǎn)物EAAI為65.76，表明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，可作為潛在的海鮮調(diào)味基料。

2.3 酶解液發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性香味物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化分析

不同發(fā)酵階段發(fā)酵液中揮發(fā)性化合物的GC-IMS圖譜如圖7所示，橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰(reaction ion peak， RIP，經(jīng)歸一化處理)，RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大[25]?？梢钥闯?，GC-IMS技術(shù)可以很好地分離不同樣本的特征揮發(fā)性組分，且不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在組成成分及含量上存在明顯差異，即使同種物質(zhì)在不同階段濃度也有較大差異，如圓圈中的標(biāo)注的物質(zhì)。

通過(guò)GC-IMS自帶軟件Library Search中現(xiàn)有的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)和G.A.S. 的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)保留時(shí)間和遷移時(shí)間對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢索，比對(duì)出31種揮發(fā)性化合物，主要包括11種醛類、7種醇類、8種酮類、1種酯類、1種烴類及3種呋喃類化合物，結(jié)果見(jiàn)表6。

為了進(jìn)一步研究不同發(fā)酵階段揮發(fā)性化合物的變化情況，圖8顯示發(fā)酵0、6、12和18 d的發(fā)酵液及對(duì)照組中已經(jīng)比對(duì)出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GGC-IMS部分指紋圖譜，圖中每一行代表一個(gè)樣品中選取的全部信號(hào)峰，每一列代表同一種揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號(hào)峰，亮點(diǎn)的深淺表示化合物含量的高低。A區(qū)的物質(zhì)是對(duì)照組中未發(fā)酵酶解液的特征風(fēng)味物質(zhì)，包括1-辛烯-3-酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛和2-乙酰基呋喃等；而B(niǎo)區(qū)的物質(zhì)是發(fā)酵初期(0 d)的特征風(fēng)味化合物，包括苯甲醛、壬醛和2-正戊基呋喃等；C區(qū)的物質(zhì)在對(duì)照組和發(fā)酵初期大量存在，包括辛醛、2-己烯-1-醇、庚醛、己醛、2-乙基呋喃、乙酸乙酯、丁醛和3-甲硫基丙醛等；D區(qū)的少量物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)含量逐漸升高，如E-3-己烯-1-醇等，可能是由于這個(gè)階段又有酵母參與發(fā)酵或者某些化合物發(fā)生反應(yīng)以及隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸積累，為發(fā)酵終止時(shí)(18 d)的特征峰區(qū)域；E區(qū)的物質(zhì)在發(fā)酵6 d時(shí)含量最高，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，2-己酮、2-戊酮、1-辛烯-3-醇等部分風(fēng)味物質(zhì)含量降低；而F區(qū)的物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中逐漸積累，并在發(fā)酵12 d時(shí)含量最高，繼續(xù)發(fā)酵時(shí)含量隨之減少，包括2-丁酮、3-戊酮、3-辛酮、2-甲基-1-丙醇和糠醛等風(fēng)味物質(zhì)；G區(qū)中的物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，部分物質(zhì)含量增加，如3-辛酮。以上結(jié)果可知，未發(fā)酵及發(fā)酵初期酶解液的主要揮發(fā)性物質(zhì)為A、B、C區(qū)的飽和直鏈醛類、呋喃類等，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，被逐漸代謝為D、E、F、G區(qū)的酮類及不飽和醇類等香氣活性物質(zhì)，并且這些揮發(fā)性香味物質(zhì)的種類和含量在發(fā)酵12 d時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味最佳。綜上，發(fā)酵后遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液的風(fēng)味品質(zhì)得到明顯改善，可作為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的海鮮調(diào)味基料，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

表5 必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)Table 5 Nutritional evaluation of essential amino acids

圖7 不同發(fā)酵階段揮發(fā)性化合物的GC-IMS圖譜Fig.7 GC-IMS plot of volatile compounds in different fermentation stages

表6 酶解液 GC-IMS 測(cè)定結(jié)果Table 6 The results of GC-IMS determination of enzymatic hydrolysate

圖8 不同發(fā)酵階段酶解液GC-IMS指紋圖譜Fig.8 GC-IMS fingerprint of different fermentation stages

3 討論

風(fēng)味菌是一類在代謝過(guò)程中將原料中的有機(jī)質(zhì)分解為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的微生物，對(duì)食物風(fēng)味品質(zhì)的形成有著重要影響。楊海寧等[17]采用貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)鳀魚(yú)進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示接種該風(fēng)味菌后，發(fā)酵醪液比未接種發(fā)酵和自然發(fā)酵具有更多種類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。陳超奇[35]在刺葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中提前接種長(zhǎng)孢洛德酵母，酒樣中的花香、小漿果及真菌的香味特征比較顯著。本研究利用長(zhǎng)孢洛德酵母對(duì)遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液進(jìn)行發(fā)酵，改善了酶解液的風(fēng)味品質(zhì)，為其在調(diào)味基料中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

風(fēng)味是在發(fā)酵過(guò)程中由不同物質(zhì)積累逐漸形成，且不同發(fā)酵階段其組成差別較大[36]。在未發(fā)酵時(shí)及發(fā)酵初期，醛類和呋喃類化合物對(duì)其風(fēng)味有著重要的影響。醛類物質(zhì)閾值較低，是發(fā)酵過(guò)程中由脂質(zhì)氧化形成的[37]。飽和直鏈醛具有令人不適的氣味[38]，給對(duì)照組及發(fā)酵0 d的發(fā)酵液風(fēng)味造成了負(fù)面影響。發(fā)酵一段時(shí)間后，發(fā)酵產(chǎn)物中醇類物質(zhì)的種類明顯增多，可能是來(lái)源于脂肪酸的二級(jí)氫過(guò)氧化物分解或羰基化合物還原[39]，也可能是來(lái)源于酵母在發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，可作為風(fēng)味形成的基礎(chǔ)物質(zhì)。而一些不飽和醇閾值較低，可能會(huì)對(duì)發(fā)酵液風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)，如在發(fā)酵6 d時(shí)明顯增多的1-辛烯-3-醇具有類似蘑菇的風(fēng)味[26]，此類成分使得發(fā)酵產(chǎn)物整體品質(zhì)更佳。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵產(chǎn)物中酮類物質(zhì)的種類和含量逐漸增多，并在12 d時(shí)達(dá)到峰值，是發(fā)酵中后期的主體風(fēng)味物質(zhì)。酮類物質(zhì)是由多不飽和脂肪酸或氨基酸降解以及微生物氧化產(chǎn)生，通常具有獨(dú)特的清香或者果香風(fēng)味[40]，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味的改良起著重要作用。由此可見(jiàn)，不同發(fā)酵階段產(chǎn)物中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在差異。

游離氨基酸既是發(fā)酵產(chǎn)物鮮味的重要成分，也可以與其他組分相互作用，改善產(chǎn)物的風(fēng)味，同時(shí)也是評(píng)價(jià)發(fā)酵產(chǎn)物的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)長(zhǎng)孢洛德酵母發(fā)酵12 d后，發(fā)酵產(chǎn)物中Ile等7種必需氨基酸和Glu等鮮味氨基酸的總量比發(fā)酵前明顯增多。此外Ala、Gly等含量較高，使得發(fā)酵產(chǎn)物的鮮味更加醇厚，品質(zhì)較發(fā)酵前有顯著提升。

綜上，為改善遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液的風(fēng)味品質(zhì)，采用長(zhǎng)孢洛德酵母發(fā)酵12 d后，產(chǎn)物的香味濃郁，品質(zhì)較高。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)考察了發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味品質(zhì)的影響，采用電子鼻PCA分析，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，在發(fā)酵時(shí)間為12 d、發(fā)酵溫度為40℃，pH值為5.0時(shí)，發(fā)酶產(chǎn)物風(fēng)味品質(zhì)最佳，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分值較高。發(fā)酵產(chǎn)物的EAAI為65.76，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較好。GC-IMS分析結(jié)果表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵產(chǎn)物中不飽和醇類、酮類等香氣活性物質(zhì)明顯增多，并在12 d時(shí)達(dá)到最高，而飽和直鏈醛等具有不良風(fēng)味的物質(zhì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸消失或減少。