肖文斐 柴偉國(guó) 裘劼人 忻 雅 阮松林

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 杭州 310024)

植物免疫誘導(dǎo)劑是一類能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性的免疫活性化合物，活性糖類物質(zhì)是其中重要的類型之一[1]。殼寡糖和海藻寡糖等低聚糖能增強(qiáng)多種作物的抗病能力，前人對(duì)其用途和功能也進(jìn)行了大量研究[2-4]。研究表明，一些多糖類物質(zhì)也具有調(diào)節(jié)植物免疫及生長(zhǎng)的作用，如殼聚糖可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)病原菌抗性及非生物抗逆性[5-6]；黃芪多糖能夠提高小葉楊的葉綠素含量及氧化酶活性[7]；靈芝[8]、云芝[9]、香菇[10-11]多糖等多種真菌多糖被證實(shí)具有誘導(dǎo)植物對(duì)病毒及真菌病害的抗性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。杭州市農(nóng)科院植物免疫誘抗課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大球蓋菇等食用菌多糖能促進(jìn)水稻幼苗發(fā)育，提高其葉綠素含量及抗氧化酶活性[12]。

紅陽(yáng)獼猴桃(ActinidiachinensisHongyang)屬獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)，是我國(guó)選育的首個(gè)紅肉型獼猴桃品種。鮮果營(yíng)養(yǎng)豐富、食用品質(zhì)優(yōu)異，但由于其在抗病性、生長(zhǎng)勢(shì)、抗熱性、耐貯性等方面存在缺陷，致使該品種的種植難度較大[13]。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所在陜西地區(qū)獼猴桃上應(yīng)用的寡糖類植物疫苗與噻霉酮集成防治方案，對(duì)獼猴桃潰瘍病的防效達(dá)90%左右，同時(shí)使獼猴桃產(chǎn)量增加19%，抗逆性顯著增強(qiáng)[14]。但多糖類物質(zhì)在獼猴桃上的應(yīng)用效果及作用機(jī)制還鮮見報(bào)道。

蛋白質(zhì)組學(xué)能從整體水平研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分及其變化規(guī)律。作為一種重要的功能基因篩選方法，蛋白質(zhì)組學(xué)也被應(yīng)用到植物誘導(dǎo)抗性的機(jī)制研究之中。Lematre-Guillier等[15]通過(guò)雙向電泳法揭示硫酸化修飾的β-1,3葡聚糖(sulfated β-1,3 glucan, PS3)對(duì)葡萄抗霜霉病的誘導(dǎo)抗性與初級(jí)代謝激活有關(guān)。Possa等[16]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，綠色力量-銅鈣鹽(Greenforce CuCa)和苯并噻二唑兩種激發(fā)子對(duì)咖啡葉銹病的誘導(dǎo)抗性均能引起代謝調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)與光合作用、蛋白質(zhì)代謝和脅迫反應(yīng)有關(guān)，但兩種激發(fā)子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)不完全相同。張青等[17]通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究了免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)誘導(dǎo)黑李葉片促生長(zhǎng)作用的分子機(jī)制。

本研究以紅陽(yáng)獼猴桃為試驗(yàn)材料，通過(guò)檢測(cè)大球蓋菇噴施處理后獼猴桃葉片的大小、厚度、葉綠素、多酚氧化酶指標(biāo)及蛋白質(zhì)組的變化，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等層次探討多糖對(duì)獼猴桃生長(zhǎng)及抗逆性的影響，挖掘相關(guān)的功能基因及關(guān)鍵途徑，探索其促進(jìn)獼猴桃生長(zhǎng)及抗高溫的分子機(jī)制，旨在為多糖類免疫誘導(dǎo)劑的開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本試驗(yàn)于2018年在臨安市清涼峰鎮(zhèn)頰口村獼猴桃基地進(jìn)行。試驗(yàn)所用獼猴桃品種為紅陽(yáng)，從四川省蒼溪縣引進(jìn)，采用山地露天栽培，株齡3年。各試驗(yàn)果樹生長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致，樹勢(shì)中庸，栽培管理水平較好。大球蓋菇子實(shí)體干制品購(gòu)于福建縉云食用菌家庭農(nóng)場(chǎng)。

兒茶酚、愈創(chuàng)木酚、巰基乙醇、苯甲基磺酰氟、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、乙二胺四乙酸，美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶，美國(guó)Promega公司；Amicon Ultra-0.5(10kD)超濾管，德國(guó)默克密理博公司；C18固相萃取柱，德國(guó)Qiagen公司；乙腈、甲酸、甲醇，美國(guó)Thermo Fisher公司；Tris飽和酚，上海生工公司；Bradford法蛋白定量試劑盒，上海碧云天公司；蔗糖、乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2550分光光度計(jì)，日本島津公司；調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGING-PAM，德國(guó)WALZ公司；YMJ-B葉面積儀、YH-1厚度儀，浙江托普云公司；BX53熒光正置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；真空干燥儀5305，德國(guó)Eppendorf公司；EASY-nLC1000液相和Q-Exactive高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大球蓋菇多糖提取及田間噴施處理 參照文獻(xiàn)[12]方法，采用熱水浸提法提取大球蓋菇多糖并進(jìn)行去蛋白處理，乙醇沉淀后真空冷凍干燥得到粗多糖。利用苯酚-硫酸法[18]測(cè)定多糖含量。

試驗(yàn)設(shè)大球蓋菇多糖水劑和常規(guī)對(duì)照處理。每一處理選取兩行進(jìn)行噴施。常規(guī)處理中對(duì)獼猴桃病害防治的方案如下：2月在植株萌芽前15～20 d，對(duì)獼猴桃整個(gè)園區(qū)噴施3～5波美度的石硫合劑1次；3月展葉期噴施20%噻菌銅500倍液1次；4月開花前噴施50%氯溴異氰尿酸1 500倍液1次，開花后噴施3%中生菌素800倍液、20%氰戊菊酯3 000倍液2次，間隔期10 d左右；5月噴施70%吡蟲啉15 000倍液1次，80%代森錳鋅500倍液1次；6月噴施70%甲基硫菌靈1 500倍、20%噻唑鋅600倍液、1.8%阿維菌素600倍液各1次；7月施用80%代森錳鋅500倍液、32.5%苯甲嘧菌酯1 500倍液1次、20%氰戊菊酯3 000倍液各1次；8月施用50%氯溴異氰尿酸1 500倍液1次，70%吡蟲啉15 000倍液1次。用藥間隔期一般在10～15 d。大球蓋菇多糖處理是在常規(guī)用藥的基礎(chǔ)上增設(shè)多糖水劑噴施。自2018年4月12日開始，每半個(gè)月左右，進(jìn)行大球蓋菇多糖水劑與農(nóng)藥混配噴施(多糖終濃度為0.15 mg·L-1)，共噴施5次。

1.3.2 葉片參數(shù)測(cè)定及觀察 隨機(jī)選取10株獼猴桃果枝上完全成熟的葉片，每株3片，共分為3組，每組為1重復(fù)，測(cè)定面積和厚度。后續(xù)測(cè)定取樣方式與此一致。

各處理選取相同部位葉片，石蠟包埋后制作切片，番紅-固綠染色后封片，具體方法參照文獻(xiàn)[17]。顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus軟件測(cè)量葉片組織厚度。

1.3.3 葉綠素含量測(cè)定 稱取獼猴桃相同部位葉片0.25 g并重復(fù)3次，置于研缽中，加入5 mL 95%乙醇與少許石英砂，充分研磨至組織變白，再加入5 mL 95%乙醇，將研缽壁上的組織及液體充分洗滌后一并轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)，靜置3～5 min，用95%乙醇定容至15 mL，3 000×g離心15 min，取離心后的上清液1 mL，加95%乙醇4 mL，用分光光度計(jì)測(cè)定665、649 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，以95%乙醇為空白對(duì)照，葉綠素濃度(mg·L-1)=18.16×A649+6.63×A665。

1.3.4 酶活性測(cè)定 參照邱德文[19]的方法測(cè)定多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性。稱取0.1 g葉片，加1.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH值7.2)磨成勻漿，離心后取0.5 mL上清，加50 mmol·L-1兒茶酚溶液1.5 mL，2 mL磷酸緩沖液，40℃水浴1 h，于525 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以每克鮮重每小時(shí)的光密度(optical density, OD)大小表示PPO活性。

稱取0.1 g葉片，加1.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1， pH值6.0)磨成勻漿，離心后取0.1 mL上清，加4 mL反應(yīng)液(含0.038%愈創(chuàng)木酚和0.017% H2O2的50 mmol·L-1磷酸緩沖液，pH值6.0)，用動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定470 nm波長(zhǎng)下吸光度值變化。以每克鮮重每分鐘的OD值變化量表示POD活性。

1.3.5 獼猴桃葉片葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定 為了明確大球蓋菇多糖處理對(duì)高溫脅迫下獼猴桃葉片的影響，在連續(xù)高溫(最高氣溫38℃～39℃)的第3日午后采集葉片，測(cè)定其Fv/Fm。參照王淑珍等[20]的方法。測(cè)定前葉片先暗適應(yīng)30 min，然后置于葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)照射區(qū)，在超強(qiáng)的飽和脈沖光作用下測(cè)定葉片最小熒光產(chǎn)量(minimal fluorescence, Fo)和最大熒光產(chǎn)量(maximal fluorescence, Fm)以及暗適應(yīng)PSⅡ最大光合效率(Fv/Fm)。

1.3.6 獼猴桃葉片總蛋白的提取及定量 參照文獻(xiàn)[21]并加以改進(jìn)。稱取新鮮獼猴桃葉片0.2 g，用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2 mL 離心管，迅速加入0.8 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的蛋白提取液(0.7 mol·L-1蔗糖，0.1 mol·L-1KCl，0.5 mol·L-1Tris-HCl，50 mmol·L-1乙二胺四乙酸，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟和2%巰基乙醇，pH值7.5)混勻，再加入0.8 mL預(yù)冷的Tris飽和酚(pH值7.5)，置冰上放置30 min，期間取出振蕩3～5次，于4℃條件下5 000×g離心30 min。取上層酚液加入等量蛋白提取液，重復(fù)提取1次。取上述提取酚液，加入至少5倍體積的0.1 mol·L-1醋酸銨甲醇溶液，-20℃靜置過(guò)夜。再于4℃條件下5 000×g離心30 min，棄上清。用-20℃預(yù)冷的甲醇重復(fù)清洗2次，4℃條件下5 000×g離心30 min后取沉淀，經(jīng)真空干燥后得粗蛋白粉。用裂解液(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1Tris-HCl和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，pH值8.5)復(fù)溶粗蛋白干粉，室溫放置1 h，期間取出振蕩3～5次，然后在20℃條件下5 000×g離心15 min，取上清液用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.7 蛋白還原烷基化和酶解 參照方獻(xiàn)平等[22]的方法并加以改進(jìn)。取150 μg蛋白樣品，用100 mmol·L-1NH4HCO3溶液定容至100 μL，按1∶10體積比加入100 mmol·L-1二硫代蘇糖醇至終濃度為10 mmol·L-1，在37℃條件下還原反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，按1∶10體積比加入500 mmol·L-1碘乙酰胺，室溫避光反應(yīng)30 min。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至Amicon Ultra-0.5(10 kD)超濾管中純化。先4℃條件下12 000×g離心15 min棄廢液，再用100 mmol·L-1NH4HCO3清洗2次，離心棄廢液。更換新的收集管，加入100 mmol·L-1NH4HCO3至總體積100 μL，按酶與蛋白質(zhì)量比1:50加入胰蛋白酶，37℃反應(yīng)12～16 h。4℃條件下12 000×g離心15 min，再向超濾管中加入100 μL的100 mmol·L-1NH4HCO3溶液，重復(fù)離心1次，合并2次離心得到的溶液即為酶解的肽段溶液。肽段經(jīng)C18固相萃取柱脫鹽處理并真空干燥。

1.3.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及分析 參照文獻(xiàn)[17]。真空干燥后的肽段用含0.1%甲酸的去離子水溶液復(fù)溶至1 μg·μL-1，每組分上樣2 μL。采用EASY-nLC1000液相系統(tǒng)對(duì)肽段進(jìn)行分離。流動(dòng)相A液為含0.1%甲酸的水溶液；B液為含0.1%甲酸的乙腈溶液。線性洗脫梯度(B液) 4%～7%，4 min；7%～14%，62 min；14%～19%，22 min；19%～34%，15 min；34%～84%，17 min；流速為200 nL·min-1。肽段經(jīng)超高效液相色譜系統(tǒng)分離、NSI離子源電離后進(jìn)入Q-Exactive質(zhì)譜系統(tǒng)分析。

二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用 Maxquant搜索引擎(v1.6.0.1)進(jìn)行分析，檢索參數(shù)設(shè)置參照文獻(xiàn)[17]。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為獼猴桃基因組推測(cè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，包含39 040條蛋白序列(Hongyang_pep_v1.0.fa.gz，ftp://cucurbitgenomics.org/pub/kiwifruit/)。

1.3.9 差異蛋白篩選、功能注釋及分析 使用Perseus軟件(版本1.6.0.2)對(duì)蛋白譜峰強(qiáng)度進(jìn)行非標(biāo)記相對(duì)定量，以蛋白表達(dá)差異倍數(shù)(fold change)≥1.5倍或≤0.67倍且P<0.05為差異蛋白標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行篩選。

利用百邁客云平臺(tái)(http://www.biocloud.net)工具軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能注釋及基因本體(gene ontology, GO)匹配及富集分析(P<0.05)；利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)網(wǎng)絡(luò)信號(hào)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行KEGG代謝信號(hào)通路匹配及富集分析(P<0.05)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用DPSv7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，同時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行顯著性分析，采用WPS Office 2013制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇多糖與對(duì)照處理的獼猴桃葉片表型比較分析及葉綠素含量測(cè)定

葉片面積和厚度等性狀比較結(jié)果表明，施用大球蓋菇多糖后，獼猴桃葉片面積變大(圖1-A)，葉片厚度相比對(duì)照增加了28.9%，達(dá)極顯著差異(圖1-B)。進(jìn)一步對(duì)葉片橫切面進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果顯示處理后的葉片柵欄組織和海綿組織排列緊密，厚度增加(圖1-C)，表皮組織無(wú)明顯變化。葉綠素含量測(cè)定結(jié)果表明，處理后葉片的葉綠素含量比對(duì)照增加了57.4%，達(dá)極顯著差異(圖1-D)。

注：A：葉片表型；B：葉片厚度；C：葉片橫切面；D：葉綠素含量；直方柱上**表示差異達(dá)到 極顯著水平(P<0.01)，*表示差異為顯著水平(P<0.05)。下同。Note: A: Phenotype of leaf. B: Leaf thickness.C: Blade transverse section. D: Chlorophyll content. On the square column, ** indicates significant difference at P<0.01, while * indicates significant difference at P<0.05. The same as following.圖1 大球蓋菇多糖處理與對(duì)照的獼猴桃葉片表型及葉綠素含量比較Fig.1 Phenotype and chlorophyll content of kiwifruit leaves treated with SPS and control

2.2 大球蓋菇多糖處理對(duì)高溫脅迫下獼猴桃葉片光合特性的影響

注：A：正常溫度對(duì)照葉片；B：正常溫度處理葉片； C：高溫脅迫對(duì)照葉片； D：高溫脅迫處理葉片； E：最大光化學(xué)效率Fv/Fm。Note: A: Control leaf at normal temperature. B: Treated leaf at normal temperature. C: Control leaf at high temperature stress. D: Treated leaf at high temperature stress. E: Maximal photochemical efficiency Fv/Fm.圖2 大球蓋菇多糖處理與對(duì)照的獼猴桃葉片葉綠素?zé)晒獬上駡D及最大光化學(xué)效率比較Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence images and maximal photochemical efficiency of kiwifruit leaves treated with S. rugosoannulata polysaccharides and control

葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm反映了光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ， PSII)反映了PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率以及環(huán)境因素對(duì)PSⅡ電子傳遞系統(tǒng)的影響效應(yīng)，已被廣泛用于植物的早期脅迫檢測(cè)[23]。結(jié)果如圖2所示，正常生長(zhǎng)條件下對(duì)照和處理組葉片F(xiàn)v/Fm平均值分別為0.76和0.79；高溫脅迫后，對(duì)照葉片F(xiàn)v/Fm平均值顯著下降至0.64，而處理葉片F(xiàn)v/Fm與正常生長(zhǎng)條件下的比值差異不顯著。說(shuō)明處理組的光抑制程度較小，抗高溫性強(qiáng)于對(duì)照。通過(guò)后期的植株表型觀察發(fā)現(xiàn)(圖3)，對(duì)照植株在持續(xù)高溫脅迫下，葉片日灼傷害及脫落嚴(yán)重，果實(shí)數(shù)量減少；而處理植株的葉片傷害及脫落程度輕，果實(shí)數(shù)量多。

注：A：葉片表型；B：對(duì)照植株；C：處理植株。Note: A: Phenotype of leaves. B: Control plants. C: Treated plants.圖3 高溫脅迫下的大球蓋菇多糖處理與對(duì)照獼猴桃植株表型Fig.3 Phenotype of kiwifruit plants treated with S. rugosoannulata polysaccharides and control under high temperature stress

圖4 大球蓋菇多糖處理與對(duì)照的獼猴桃葉片POD和PPO活性比較Fig.4 Comparison of POD and PPO activities of leaves treated with S. rugosoannulata polysaccharide and control

2.3 大球蓋菇多糖處理對(duì)高溫脅迫下獼猴桃葉片抗氧化酶活性的影響

POD及PPO活性的高低是植物抗性的重要指標(biāo)[24-26]。通過(guò)對(duì)高溫脅迫獼猴桃葉片POD和PPO活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，大球蓋菇多糖處理后葉片POD(圖4-A)和PPO活性(圖4-B)均顯著增加，推測(cè)大球蓋菇多糖處理具有誘導(dǎo)抗逆性的潛在作用。

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量分析

通過(guò)采集高溫脅迫下的處理組及對(duì)照組獼猴桃葉片蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多庫(kù)搜索分析，共鑒定到獼猴桃蛋白3 507個(gè)。利用Perseus軟件，并結(jié)合Welch’s t-test篩選出326個(gè)差異蛋白，其中大球蓋菇多糖處理相比對(duì)照上調(diào)表達(dá)蛋白166個(gè)(顯著上調(diào)1.5倍)，下調(diào)表達(dá)蛋白160個(gè)(顯著下調(diào)1.5倍)。

2.5 差異蛋白質(zhì)GO功能分類

對(duì)以上326個(gè)差異蛋白進(jìn)行了GO功能注釋，按照生物學(xué)過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)進(jìn)行了分類，結(jié)果如圖5所示。在生物學(xué)進(jìn)程中，差異蛋白主要參與代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單組織過(guò)程和刺激應(yīng)答；在分子功能分類中，差異蛋白主要為催化和連接活性類功能，還有部分轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化及電子載體活性類功能蛋白；而在細(xì)胞組分分類中，差異蛋白質(zhì)較多位于各種形式細(xì)胞器和細(xì)胞膜中，且往往參與了大分子復(fù)合體的組成。

2.6 差異表達(dá)蛋白的功能與代謝通路富集分析

為了進(jìn)一步揭示蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，本研究對(duì)差異蛋白分別進(jìn)行了GO富集和KEGG通路富集分析。GO富集分析結(jié)果表明，差異蛋白在葉綠體、葉綠體基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、類囊體部分及光合膜等細(xì)胞組分子集的富集程度最高；在生物過(guò)程中，富集程度最高的5個(gè)子集的依次是光合作用、熱應(yīng)答、無(wú)機(jī)質(zhì)應(yīng)答、氧化還原過(guò)程及脅迫應(yīng)答；而催化活性、氧化還原酶活性、四吡咯結(jié)合、異構(gòu)酶活性及水解酶活性等子集的富集程度則位于分子功能的前列(圖6-A)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)(P<0.05，圖6-B)，大球蓋菇多糖參與了糖代謝、氨基酸代謝等初級(jí)代謝途徑的調(diào)節(jié)，顯著影響了α-亞麻酸代謝、維生素B6代謝、類胡蘿卜素生物合成及類黃酮生物合成途徑等次生代謝途徑。表1中列出了部分富集途徑重要差異表達(dá)蛋白的定量信息。

3 討論

柵欄組織和海綿組織是葉綠體的主要分布部位，這些組織的增厚可能是大球蓋菇多糖提高獼猴桃葉綠素含量及Fv/Fm比值的基礎(chǔ)。與此對(duì)應(yīng)的是，在本試驗(yàn)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，GO二級(jí)注釋結(jié)果顯示大球蓋菇多糖誘導(dǎo)的差異應(yīng)答蛋白質(zhì)在葉綠體尤其在PSⅡ中顯著富集，且11個(gè)差異蛋白均為上調(diào)表達(dá)。這些蛋白主要包括PSⅡ反應(yīng)中心核心蛋白D2，核心天線蛋白CP26、CP43和CP47，葉綠素結(jié)合蛋白及產(chǎn)氧增強(qiáng)蛋白等。其中產(chǎn)氧增強(qiáng)蛋白1(Achn091501)是所有差異蛋白中表達(dá)量上調(diào)最多的，高達(dá)222.56倍，其他蛋白的表達(dá)量分別為對(duì)照的1.51～3.76倍。光系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ, PSⅠ)的膜內(nèi)周蛋白PsaK也上調(diào)了1.85倍(表1)。PSⅠ和PSⅡ是生物光能轉(zhuǎn)換的重要場(chǎng)所，涉及水裂解放氧反應(yīng)和原初電荷分離等關(guān)鍵步驟，是決定光合作用效率的重要部位[27]。這些重要的光合作用相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，為促進(jìn)獼猴桃的生長(zhǎng)發(fā)育及光合作用提供了分子基礎(chǔ)。

表1 部分富集途徑差異表達(dá)蛋白定量信息Table 1 Quantitation information of differentially expressed proteins in partial enrichment pathways

表1(續(xù))

圖6 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能(A)和KEGG代謝通路富集(B)分析Fig.6 GO function (A) and KEGG pathway enrichment (B) analysis of differentially expressed proteins

圖5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能歸類分析Fig.5 GO functional category analysis of differentially expressed proteins

富集并指定參與熱應(yīng)答相關(guān)途徑的14個(gè)差異蛋白中，有13個(gè)蛋白的表達(dá)相對(duì)下調(diào)，其中大部分是熱休克蛋白類分子伴侶蛋白(表1)。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是植物在高溫等逆境環(huán)境下或發(fā)育特殊時(shí)期產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，并通過(guò)分子伴侶機(jī)制保護(hù)逆境中的細(xì)胞[28-29]。葉綠素?zé)晒獬上駡D顯示，對(duì)照組葉片在高溫脅迫下受到了光抑制，而大球蓋菇處理葉片中Fv/Fm比值較為穩(wěn)定。由此可以推測(cè)對(duì)照組細(xì)胞在高溫脅迫下細(xì)胞受到傷害，啟動(dòng)了熱脅迫應(yīng)答機(jī)制；而處理組細(xì)胞中蛋白相對(duì)穩(wěn)定，熱脅迫應(yīng)答還未被完全激活。此外，還有大量的差異蛋白富集在脅迫應(yīng)答相關(guān)途徑，只是基因及其表達(dá)程度不同，既有上升也有下降，說(shuō)明大球蓋菇多糖對(duì)這些途徑的蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)保持平衡。

POD可以催化許多重要酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)，參與木質(zhì)素的聚合過(guò)程，亦能催化產(chǎn)生對(duì)病原菌有毒性的酚類物質(zhì)，抑制病原菌的增殖和擴(kuò)展，與植物抗病性有密切關(guān)系[24]，同時(shí)也是植物耐熱性鑒定的重要指標(biāo)[26]。經(jīng)大球蓋菇多糖處理后，獼猴桃葉片中POD活性和PPO活性明顯增加。蛋白組學(xué)分析結(jié)果也表明，有9個(gè)過(guò)氧化物酶類蛋白呈現(xiàn)出差異表達(dá)，其中7個(gè)表達(dá)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)，而過(guò)氧化物酶Achn175281的表達(dá)量上調(diào)最多，達(dá)到對(duì)照的49.10倍。差異蛋白中，還有6個(gè)與細(xì)菌應(yīng)答相關(guān)的蛋白被誘導(dǎo)上升表達(dá)(表1)。推測(cè)大球蓋菇多糖具有誘導(dǎo)抗病的潛在作用，但對(duì)病害的具體防治效果還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一種重要的高度保守的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)、生物脅迫以及非生物脅迫的應(yīng)答響應(yīng)。植物在受到外界刺激后，可通過(guò)激發(fā)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而啟動(dòng)下游系列的防御反應(yīng)[30]。Harpin、鞭毛蛋白質(zhì)FLG22、殼寡糖等激發(fā)子都需通過(guò)MAPK應(yīng)答進(jìn)行信號(hào)傳遞[31]。大球蓋菇多糖處理后誘導(dǎo)NTF6 和MAPK4 2個(gè)MAPK類蛋白上調(diào)表達(dá)，初步推測(cè)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了其中的信號(hào)傳遞。

次生代謝產(chǎn)物是植物抵御病害和環(huán)境脅迫防御系統(tǒng)的重要組成部分，但較高的積累可能產(chǎn)生毒性并損害植物產(chǎn)品的質(zhì)量。次生代謝產(chǎn)物在植物生長(zhǎng)與防御之間取得平衡的最佳積累量更有利于植物在逆境中健康生長(zhǎng)[32]。與對(duì)照相比，經(jīng)大球蓋菇多糖處理后獼猴桃的α-亞麻酸代謝、維生素B6代謝、類胡蘿卜素生物合成及類黃酮生物合成途徑都受到了不同程度的調(diào)節(jié)，其中富集在α-亞麻酸代謝途徑中的差異蛋白均呈上調(diào)趨勢(shì)，而富集在其他3條代謝途徑的蛋白大多為下調(diào)表達(dá)(表1)。大球蓋菇多糖可能通過(guò)對(duì)次生產(chǎn)物代謝途徑的調(diào)節(jié)，來(lái)維持植物生長(zhǎng)和抵抗逆境的平衡。

α-亞麻酸代謝是茉莉酸類化合物(jasmonates, JAs)生物合成的主要途徑，而JAs作為一種重要植物內(nèi)源激素廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程[33]。JAs也被證實(shí)是調(diào)節(jié)植物誘導(dǎo)抗性的重要小分子信號(hào)物質(zhì)。如前人研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖誘導(dǎo)油菜抗菌核病由茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑介導(dǎo)[34]；免疫誘導(dǎo)蛋白阿泰靈能誘導(dǎo)柑橘CsLOX2.1等JA合成關(guān)鍵基因的上調(diào)表達(dá)[35]；在β-1,3葡聚糖對(duì)葡萄抗霜霉病的誘導(dǎo)抗性中，12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxo-phytodienoiCAcid reductase, OPR)被建議作為誘導(dǎo)抗性的標(biāo)記物[15]。從本研究JAs生物合成途徑蛋白被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的結(jié)果推測(cè)，JAs介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能也參與了大球蓋菇多糖對(duì)獼猴桃生長(zhǎng)和抗逆的調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，施用大球蓋菇多糖可以使獼猴桃葉面積增加、葉片組織增厚、葉綠素含量提高。高溫脅迫條件下，經(jīng)大球蓋菇多糖處理的植株的Fv/Fm比值、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶活性均高于對(duì)照。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，光合作用、脅迫應(yīng)答、氧化還原、次生代謝產(chǎn)物等相關(guān)蛋白呈現(xiàn)差異表達(dá)。綜上所述，大球蓋菇多糖具有促進(jìn)獼猴桃生長(zhǎng)發(fā)育和誘導(dǎo)抗性的功能，本結(jié)果為后續(xù)多糖類誘導(dǎo)劑研究提供了理論基礎(chǔ)。