何淑雯 胡海靜 陸許秋 王浩東 王虎虎 徐幸蓮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量 安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種重要的食源性致病菌，在全球范圍內(nèi)每年可造成大量的食品安全事件并造成食品行業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在食品加工過程中的接觸表面形成生物菌膜是沙門氏菌實現(xiàn)傳播和污染的重要途徑。生物菌膜是細(xì)菌粘附于接觸表面后，通過增殖和分泌物胞外多聚物而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物群體[3]。越來越多的證據(jù)表明，控制生物菌膜形成過程的分子網(wǎng)絡(luò)受到非編碼sRNA的調(diào)控。非編碼sRNA是一類在基因組中轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的RNA。目前，生物菌膜的形成在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制已成為食品安全的研究熱點，但現(xiàn)有調(diào)控通路仍不能完全解釋腸炎沙門氏菌的粘附過程。sRNA SaaS (Salmonellaadhesion associated sRNA) 是近期在肉品源腸炎沙門氏菌中篩選出的一種新型調(diào)控因子，結(jié)晶紫染色試驗結(jié)果顯示該sRNA能夠顯著抑制生物菌膜的形成，但其具體功能和調(diào)控路徑尚不清楚[4]。

生物菌膜的形成離不開物理接觸表面的存在，在食品生產(chǎn)和日常生活中，機(jī)械加工設(shè)備和不同材質(zhì)食品盛裝器具的表面均可成為細(xì)菌粘附的載體。了解細(xì)菌在接觸表面的粘附響應(yīng)規(guī)律對于理解粘附因子的具體功能具有指導(dǎo)意義。近年來，相關(guān)研究或多以不銹鋼作為接觸面材質(zhì)加以展開[5-6]，或?qū)Νh(huán)境溫度的設(shè)置較為單一[7-8]，而同時使用多種材質(zhì)的接觸面并在多個溫度下進(jìn)行觀測的研究相對較少。

胞外代謝物是生物菌膜的重要組成部分，解析胞外代謝物有助于更直觀有效地了解生物菌膜的形成過程及其機(jī)理。代謝組學(xué)通過對所有代謝物進(jìn)行分析，提供代謝途徑中發(fā)生變化的關(guān)鍵信息，從而揭示生物體生命活動發(fā)生和發(fā)展的本質(zhì)[9]。廣泛靶向代謝組學(xué)(widely-targeted metabolomics)結(jié)合了靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)兩種傳統(tǒng)分析方法的優(yōu)點，能夠利用基于多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)的四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法(QTRAP)，對代謝物實現(xiàn)準(zhǔn)確的鑒定和檢測[10]。近年來，代謝組學(xué)已廣泛運用到微生物領(lǐng)域[11-13]。

針對上述現(xiàn)象和問題，本研究以分離自肉品加工接觸面的腸炎沙門氏菌為試驗對象，使用前期成功構(gòu)建的sRNA SaaS基因缺失突變株為試驗組，野生株為對照組，對浮游態(tài)和粘附態(tài)兩種生存形式的菌體展開試驗；通過研究細(xì)菌的粘附響應(yīng)規(guī)律初步判定SaaS的作用條件；進(jìn)一步利用廣泛靶向代謝組學(xué)方法對胞外代謝物進(jìn)行分析，以期揭示SaaS對生物菌膜形成的分子機(jī)制提供線索，完善生物菌膜的理論體系，為研發(fā)生物菌膜新型控制技術(shù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar, TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase/tryptic soy broth，TSB)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine deoxycholate agar，XLD)，青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、乙醇，德國Merck公司。

本試驗所用腸炎沙門氏菌(S.Entertidis NCM 61，Accession：PRJNA492709)分離自冰鮮雞肉屠宰分割臺接觸面，sRNA SaaS缺失突變株由λ-Red 同源重組技術(shù)構(gòu)建得到[3]。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO Ⅱ Advance 4生物安全柜，美國BAKER公司；SQL 1010C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠；QTRAP 6500+質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；UPLC 30A色譜儀，日本SHIMADZU公司；5427 R臺式高速冷凍離心機(jī)離心機(jī)，德國艾本德Eppendorf股份公司；easySpiral Pro全自動螺旋接種儀，法國Interscience有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液準(zhǔn)備 取凍存于-80℃的腸炎沙門氏菌野生株和突變株，室溫溶解后，在XLD平板上劃線，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于TSB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h后，吸取菌懸液并接種至新鮮的TSB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18 h，制成初始濃度為109CFU·mL-1的菌懸液，作為工作菌液。

1.3.2 粘附響應(yīng)規(guī)律 將標(biāo)準(zhǔn)尺寸(75 mm×25 mm×1 mm)的不銹鋼、玻璃、聚丙烯3種材質(zhì)的接觸表面薄片(以下簡稱“薄片”)均勻地插入塑料支架，使薄片直立地分布于可密封玻璃容器中，高壓滅菌(121℃、15 min)后備用。使用TSB培養(yǎng)基將工作菌液稀釋至102CFU·mL-1，隨后注入上述玻璃容器中，菌懸液的用量能夠使薄片一半浸沒于液體，一半暴露于空氣中。密封后，于15、20、37℃分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，培養(yǎng)過程中避免液面晃動。培養(yǎng)至規(guī)定時間后，使用0.85%生理鹽水洗去薄片表面的浮游菌體，控干液體后將薄片投入裝有40 mL 生理鹽水的均質(zhì)袋中，使用拍擊式均質(zhì)器以每分鐘360下的速度連續(xù)拍擊1 min。接著使用生理鹽水對均質(zhì)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，并選取2～3個稀釋度，用全自動螺旋接種儀吸取100 μL稀釋液并均勻地涂布至TSA平板，于37℃培養(yǎng)20 h后計數(shù)。每組試驗重復(fù)4次。

1.3.3 胞外代謝組學(xué)分析

1.3.3.1 胞外多聚物的采集 使用TSB培養(yǎng)基將工作菌液稀釋至102CFU·mL-1，并接種于48孔細(xì)胞板，每塊孔板接入同一株菌，每孔接入800 μL稀釋液。同時，接種無菌TSB作為陰性對照。將細(xì)胞板置于37℃培養(yǎng)48 h。輕輕倒出48孔板中的培養(yǎng)基，用0.85%生理鹽水清洗3次后吸除每孔中殘留的液體。向任意一孔加入200 μL生理鹽水，使用無菌棉簽蘸取液體后，依次對每一孔壁進(jìn)行擦拭，將擦得的粘附體收集到2 mL無菌離心管中。再次向任意一孔加入400 μL生理鹽水，用移液槍反復(fù)吹打收集殘留的菌膜，隨后將液體轉(zhuǎn)移至下一微孔，重復(fù)上述操作，直至每孔中的菌膜被完全收集，將孔板和棉簽上的菌液全部轉(zhuǎn)移至上述2 mL離心管。離心(5 000×g，10 min，4℃)后，上清液即為胞外多聚物溶液(extracellular polymeric substances，EPS)[14]。每組試驗重復(fù)6次。

1.3.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 取50 μL的EPS，向其中加入150 μL預(yù)冷的純甲醇提取劑，渦旋1 min后，放入液氮中速凍3 min，取出，冰上解凍3 min，渦旋2 min，循環(huán)3次。離心(12 000 r·min-1，10 min，4℃)后，取上清液用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS-MS)分析。

液相條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm ×100 mm； 流動相：A相為超純水(0.04%乙酸)，B相為乙腈(0.04%乙酸)；洗脫梯度: 0 min 水/乙腈(95∶5，v/v)，11.0 min 為 5∶95 v/v，12.0 min為 5∶ 95 v/v，12.1 min 為 95∶5 v/v，14.0 min 為 95∶5 v/v；流速 0.4 mL·min-1；柱溫 40℃；進(jìn)樣量 2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)溫度500℃，質(zhì)譜電壓 5 500 V(positive)，-4 500 V(negative)，離子源氣體Ⅰ(ion source gas Ⅰ, GS Ⅰ)55 psi，氣體Ⅱ(Gas Ⅱ, GS Ⅱ)60 psi，氣簾氣(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation, CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential, DP)和碰撞能(collision energy, CE)進(jìn)行掃描檢測。

1.3.3.3 代謝物定性和定量 基于靶向標(biāo)品數(shù)據(jù)庫(metware database，MWDB)對信息進(jìn)行定性分析。代謝物定量利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)分析完成。差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：變異系數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥ 2 和 FC ≤ 0.5；變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)≥ 1。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘附響應(yīng)規(guī)律

由圖1可知，在本研究中，3種材質(zhì)的接觸表面在37℃下沙門氏菌菌體粘附數(shù)量最高，20℃次之，而15℃最低。由曲線的走勢可以發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌的粘附數(shù)量隨著時間的推移總體呈現(xiàn)出先增長后趨于平穩(wěn)并有緩慢下降的趨勢，這與生物菌膜形成過程中所經(jīng)歷的粘附、成熟、瓦解等關(guān)鍵階段吻合，生物菌膜生長規(guī)律在其中有所體現(xiàn)。值得關(guān)注的是，在37℃下，ΔSaaS的菌膜形成能力顯著大于WT，該現(xiàn)象在3種接觸面上均有發(fā)生，并在聚丙烯表面尤為明顯；而在20和15℃下，除聚丙烯表面外并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

注：A：不銹鋼表面；B：玻璃表面；C：聚丙烯表面。內(nèi)嵌圖為37℃下粘附曲線的局部放大圖。 **代表WT與ΔSaaS在0.01水平有顯著性差異。Note：A: Stainless steel surface. B: Glass surface. C: Polypropylene surface. The inline images are a zoom of the adhesion curve at 37℃. ** indicates significant differences at 0.01 level between WT and ΔSaaS.圖1 粘附響應(yīng)規(guī)律Fig.1 Adhesion law in response to environmental conditions

2.2 胞外代謝組學(xué)

2.2.1 代謝物定量結(jié)果 腸炎沙門氏菌生物菌膜胞外代謝物的定量結(jié)果如表1所示。本研究檢測到ΔSaaS和WT的代謝物總數(shù)為275；差異代謝物總數(shù)為54，其中53個顯著上調(diào)。

2.2.2 主要差異代謝物 本研究根據(jù)差異倍數(shù)大小，對檢測到的差異代謝物進(jìn)行了排名，并將排名前20的代謝物展示如下(圖2)。在顯著上調(diào)的差異代謝物中，琥珀酸和氨基丙二酸的差異倍數(shù)最大；二乙醇胺為唯一顯著下調(diào)的差異代謝物。

2.2.3 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

2.2.3.1 差異代謝物KEGG分類 本研究對差異顯著代謝物的KEGG注釋結(jié)果按照通路類型進(jìn)行了分類，分類結(jié)果如圖3所示，縱坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標(biāo)為注釋到該通路的代謝物個數(shù)及其個數(shù)占被注釋的代謝物總數(shù)的比例。本試驗差異代謝物的注釋結(jié)果主要集中于代謝途徑(92.5%)、ABC轉(zhuǎn)運蛋白(35%)、二級代謝物的生物合成(25%)、不同環(huán)境中的微生物代謝(20%)、嘧啶代謝(18%)、嘌呤代謝(15%)、氨基酸的生物合成(15%)和精氨酸和脯氨酸代謝(15%)等通路。

表1 差異代謝物數(shù)量統(tǒng)計Table 1 Statistics of differential metabolites

圖2 差異代謝物條形圖Fig.2 Bar graph of differential metabolites

2.2.3.2 差異代謝物KEGG富集 本研究對差異代謝物進(jìn)行了KEGG通路富集(圖4)。本研究中的差異代謝物較為顯著地富集于代謝途徑、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、嘧啶代謝、嘌呤代謝等通路。

3 討論

接觸表面材質(zhì)可能因為粗糙度、表面疏水性等特性的不同而影響生物菌膜的形成[15-17]。本研究以304不銹鋼、玻璃和聚丙烯塑料作為載體，并于不同環(huán)境溫度下對生物菌膜進(jìn)行培養(yǎng)，其中37℃為沙門氏菌生長的最適溫度，20℃貼近大部分肉類加工車間的環(huán)境溫度，15℃用于模擬低溫。本研究發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌在不同材質(zhì)接觸表面的粘附量并無明顯差異。而De Oliveira等[18]研究禽肉源沙門氏菌時發(fā)現(xiàn)，菌膜在玻璃、聚氯乙烯和不銹鋼上的長勢不同，且玻璃最不利于其形成。該結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，可能是由于菌株的來源或種類不同。值得注意的是，在37℃下，ΔSaaS與WT的粘附差異在初始粘附和微菌落形成階段(24 h)相對較小，在菌膜成熟階段(72和96 h)明顯擴(kuò)大。說明sRNA SaaS能夠在37℃下抑制生物菌膜的形成，且這種調(diào)控作用可能最早發(fā)生于粘附期，并在成熟期得到強(qiáng)化。基于以上發(fā)現(xiàn)，本研究進(jìn)一步對37℃下野生株與突變株生物菌膜的胞外代謝物進(jìn)行了分析。

圖3 差異代謝物KEGG分類圖Fig.3 KEGGClassification of differential metabolites

圖4 差異代謝物KEGG pathway富集結(jié)果Fig.4 Enrichment of KEGG pathways of differential metabolites

差異代謝物大量富集于ABC轉(zhuǎn)運蛋白途徑，ABC轉(zhuǎn)運蛋白屬于膜結(jié)合蛋白，對生物菌膜的形成起到重要作用[19-20]。Vanderlinde等[20]發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運蛋白的缺失會造成胞外多糖分泌減少，并使生物菌膜的形成受到嚴(yán)重?fù)p害。在本研究中，該途經(jīng)下的無機(jī)與有機(jī)離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的亞精胺、腐胺、甘氨酸甜菜堿等代謝物在突變株組發(fā)生了上調(diào)。sRNASaaS的缺失可能通過促進(jìn)亞精胺/腐胺結(jié)合周質(zhì)蛋白(spermidine/putrescine-binding periplasmic protein, PotD) 的合成，從而改變多胺的合成速率，并刺激生物菌膜的形成[21]；與此同時，甘氨酸甜菜堿也具有恢復(fù)和促進(jìn)生物菌膜形成的作用[22-23]。

嘌呤/嘧啶代謝途徑也富集了大量差異代謝物，腺嘌呤、尿嘧啶、肌苷等代謝物在突變株組發(fā)生上調(diào)。研究表明，核苷酸生物合成途徑與卷曲菌毛和纖維素的產(chǎn)生緊密相關(guān)，且嘧啶核苷酸的可用性能夠強(qiáng)烈影響卷曲蛋白操縱子的轉(zhuǎn)錄[24]。卷曲菌毛和纖維素是生物菌膜胞外多聚物的重要組分。前者與細(xì)菌在非生物表面的粘附和菌膜形成相關(guān)[25]，后者有助于成熟菌膜三維結(jié)構(gòu)的形成并對菌體細(xì)胞起保護(hù)作用[26]。而嘌呤生物合成途徑能刺激多糖的合成，外源尿嘧啶能觸發(fā)纖維素的合成，外源添加肌苷能使生物菌膜的形成量顯著增加[27-28]。sRNA SaaS的缺失可能通過刺激核苷酸的合成，加強(qiáng)EPS的分泌，從而促進(jìn)細(xì)胞間的粘附和生物菌膜的成熟。另一方面，嘌呤/嘧啶代謝涉及ATP、DNA與RNA的合成。胞外DNA(eDNA)作為胞外多聚物，起到維持菌膜三維立體結(jié)構(gòu)、為細(xì)胞提供底物和增強(qiáng)遺傳物質(zhì)交流的作用[29]。sRNA SaaS的缺失也可能通過促進(jìn)核甘酸的合成代謝，增加eDNA的合成與分泌，進(jìn)而促進(jìn)成熟菌膜的形成。

氨基酸代謝途徑也有較多差異代謝物富集，且N-乙酰天冬氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸等氨基酸在突變組發(fā)生上調(diào)。Rajendran等[30]在針對白色念珠菌(Candidaalbicans)的研究中也觀察到類似現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝在生物菌膜形成能力較強(qiáng)的分離株組中上調(diào)。氨基酸代謝是細(xì)菌正常生長的重要條件，在生物菌膜形成早期，氨基酸水平的增加有助于菌膜成熟階段細(xì)菌生物量的增加[31]。此外，與能量代謝相關(guān)的琥珀酸[32]在本試驗突變組也發(fā)生大幅上調(diào)，為變化最顯著的代謝物。這說明sRNA SaaS缺失突變株可能具有更強(qiáng)的碳代謝率，能夠更快地進(jìn)行增殖，進(jìn)而能夠在生物量的維度上更快地形成生物菌膜。

綜上，sRNA SaaS可能通過抑制氨基酸代謝和碳代謝減緩細(xì)菌的增殖，同時通過抑制嘌呤/嘧啶代謝，減少卷曲菌毛、纖維素、多糖等胞外多聚物的合成與分泌，分別從菌體細(xì)胞的數(shù)量和胞外多聚物的產(chǎn)量兩方面抑制腸炎沙門氏菌生物菌膜的形成，并阻礙菌膜三維立體結(jié)構(gòu)的維持(圖5)。

圖5 sRNA SaaS對生物菌膜形成的作用機(jī)制Fig.5 Mechanism of sRNA SaaS on biofilm formation

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)sRNA SaaS對腸炎沙門氏菌粘附能力的影響具有溫度依賴性。在37℃下，SaaS 能夠抑制該菌在304不銹鋼、玻璃和聚丙烯塑料表面形成生物菌膜，且抑制作用在聚丙烯表面尤為明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，sRNA SaaS可能一方面通過減緩細(xì)菌的增殖，另一方面通過減少卷曲菌毛、纖維素、多糖等胞外多聚物的合成與分泌，實現(xiàn)對生物菌膜形成的抑制作用。本研究成果有助于完善生物菌膜的理論體系，為揭示sRNA SaaS對生物菌膜形成的分子作用機(jī)制提供線索，為研發(fā)生物菌膜新型控制技術(shù)提供新思路。