陳世珩 呂兆豐 王道武 王楠 肖丹

摘要 為解決嚴寒地區(qū)低溫條件下農(nóng)業(yè)廢棄物自然處理效率下降的問題，從長白山典型靜水水底污泥篩選優(yōu)勢低溫降解纖維素菌并進行26S rRNA PCR測定菌種，明確其分類地位。通過全組合構(gòu)建菌株多樣性為1～5的復(fù)合菌系，分別檢測復(fù)合菌系的秸稈相對降解率及其濾紙酶、纖維素內(nèi)切酶和木聚糖酶活性，利用方差分析和相關(guān)性分析等方法研究菌株多樣性和組成對復(fù)合菌系玉米秸稈降解效果及其纖維素酶活性的影響。結(jié)果表明，篩選得到5株可在15 ℃時纖維素水解能力強且可降解玉米秸稈的菌株。經(jīng)26S rRNA序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，5株降解菌分別為鏈霉菌（Streptomyces）、棘孢木霉（T.asperellum）、鉤狀木霉（T.asperellum）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium），與NCBI數(shù)據(jù)庫的序列相似度均超過99.95%。抽樣效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株對復(fù)合菌系的秸稈降解效果、濾紙酶和纖維素內(nèi)切酶活性的影響不同。全組合復(fù)配結(jié)果表明，以編號為AX1、AX3和AM4的組合對玉米秸稈降解效果最佳、酶活性最高，復(fù)合菌系的秸稈降解能力和纖維素酶活力均高于單一菌株，且隨著菌株多樣性水平的增加而提高。試驗表明該復(fù)合菌劑可以在15 ℃下有效降解纖維素類物質(zhì)，提高玉米秸稈的降解效率效果。

關(guān)鍵詞 玉米秸稈;低溫降解;復(fù)合菌劑;構(gòu)建;降解效果

中圖分類號 X 172文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）04-0064-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Construction of Complex Microbial Agent Resistant to Low Temperature Degradation of Corn Stalk and Evaluation of Its Degradation Effect

CHEN Shi-heng，L Zhao-feng，WANG Dao-wu et al

（College of Chemical Engineering， Changchun University of Technology，Changchun，Jilin 130000）

Abstract In order to solve the problem of the decline in the efficiency of natural treatment of agricultural waste under low temperature conditions in severe cold areas， the dominant low-temperature degrading cellulose bacteria were screened from the typical still water bottom sludge of Changbai Mountain， and 26S rRNA PCR was performed to determine the bacterial species to clarify its classification status.The compound strain with a strain diversity of 1 to 5 was constructed through the entire combination，the relative degradation rate of the straw of the composite strain and its filter paper enzyme， endocellulose and xylanase activities were detected respectively，the effect of strain diversity and composition on the degradation effect of composite strains of corn stalk and its cellulase activity were studied by methods such as variance analysis and correlation analysis.The results showed that 5 strains that could hydrolyze cellulose at 15 ℃ and could degrade corn stover were selected.After 26S rRNA sequence identification and phylogenetic analysis， the 5 strains of degrading bacteria were Streptomyces， T. asperellum， T. asperellum， Aspergillus and Penicillium， the sequence similarity with NCBI database was more than 99.95%.Sampling effect analysis showed that different strains had different effects on straw degradation， filter paper enzyme and cellulose endonuclease activities. The results of the full-combination combination showed that the combination numbered AX1， AX3 and AM4 had the best degradation effect on corn stalks and the highest enzyme activity.The straw degradation ability and cellulase activity of the composite strain were higher than that of a single strain， and it increased with the increase of strain diversity.The experiment showed that the composite microbial agent could effectively degrade lignocellulose at 15 ℃， and improve the degradation efficiency of corn stalks.

Key words Corn stalk;Low temperature degradation;Complex microbial agent;Construction;Degradation effect

作者簡介 陳世珩（1996—），男，湖北恩施人，碩士研究生，研究方向：廢棄物生物降解。*通信作者，講師，博士，從事廢棄物生物降解研究。

收稿日期 2021-05-07;修回日期 2021-07-02

吉林省是我國的農(nóng)業(yè)大省，農(nóng)作物秸稈資源豐富，是尚未得到充分利用的可再生資源。秸稈中含有豐富的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)，在自然狀態(tài)下降解率不高，降低了秸稈的再利用水平[1]。尤其是吉林省因處高寒地區(qū)氣候原因，在農(nóng)作物秸稈應(yīng)用方面受到極大限制[2]，如簡單的秸稈堆肥技術(shù)因秋季溫度過低而限制降解[3]。獲得具有高效降解能力的低溫微生物，是打破高寒地區(qū)低溫氣候條件制約農(nóng)作物秸稈資源化利用的有效路徑，具有一定的實際意義[4]。

秸稈中纖維素類物質(zhì)的降解過程需要多種降解微生物和多種酶的參與[5]。因此，復(fù)合菌系具有更豐富的纖維素酶系，可通過菌株間相互協(xié)同，使其降解效果優(yōu)于單一菌株[6]。如張晨敏[7]從玉米秸稈還田土壤中篩選和組成對玉米秸稈具有較高降解效果的復(fù)合菌系，其降解效果顯著優(yōu)于單一菌株。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，菌株種類和數(shù)量過高不僅不會促進降解，反而有抑制作用。因此如何構(gòu)建效果好、穩(wěn)定性強的復(fù)合菌系是提高其在秸稈降解中應(yīng)用的重要手段[8]。該研究從長白山天然低溫靜水水體污泥中通過連代培養(yǎng)和分離純化篩選出5株低溫（15 ℃）優(yōu)勢纖維素降解菌，全組合構(gòu)建菌株豐富度為1～5的復(fù)合菌系，探究不同豐富度下玉米秸稈的降解率和酶活性，實現(xiàn)低溫區(qū)玉米秸稈快速降解回饋農(nóng)田的目標，對低溫環(huán)境下農(nóng)作物秸稈加速降解有重要的應(yīng)用意義[9]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈，由長春市某農(nóng)戶提供。污泥，取自長白山靜水水體的污泥（128.0°E、41.9°N，海拔2 467 m，年平均氣溫-2 ℃）;污泥經(jīng)吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗檢測，有機質(zhì)含量高達500 g/kg，總氮含量高達7.7 g/kg;污泥中的重金屬（汞、鉻、鉛、鎘、砷）含量亦達到了《農(nóng)用污泥中污染物控制標準》（GB 4284—84）的要求[10]?；蚪MDNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

細菌培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min[11]。

剛果紅-羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基：K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、纖維素粉1.88 g、剛果紅0.20 g、瓊脂20 g。將上述各成分混合溶解，加蒸餾水至800 mL，調(diào)整pH為7.0，補充到1 000 mL，高壓滅菌（121 ℃，15 min）[10]。溫度降至40 ℃時，無菌操作臺制作平板。

霉菌培養(yǎng)基：CMC 5.0 g、蛋白胨3.0 g、KH2PO4 4.0 g、Mg2SO4·7H2O 0.03 g、H2O 1 000 mL，pH 5.5～6.0[12]。

放線菌培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g、酵母膏0.5 g、KNO3 0.2 g、KH2PO4 4.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、微晶纖維素10.0 g、H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗秸稈預(yù)處理。農(nóng)作物玉米秸稈在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米基地采集玉米秸稈晾干，用小型粉碎機分別將秸稈粉碎為不同的粒徑，經(jīng)1.5%的NaOH浸泡預(yù)處理48 h后，用PBS反復(fù)洗凈至pH中性，在自然狀態(tài)下烘干。

1.2.2

低溫降解玉米秸稈菌株的篩選。取10 g長白山污泥樣品至裝有200 mL無菌水的三角瓶中，在150 r/min搖床振蕩3 h后，靜止30 min，吸取10 mL上清液加至90 mL剛果紅-羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基中，置于室溫下連續(xù)培養(yǎng)5 d，初步篩選出降解玉米秸稈的菌系[13]。將初步篩選出的菌株分別接種于細菌培養(yǎng)基、放線菌培養(yǎng)基上，將平板置于15 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選單菌落;然后再分別接種單菌落于細菌培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基、放線菌培養(yǎng)基，再一次進行分離。進行重復(fù)操作試驗3～5次，以選擇培養(yǎng)基是否顯示為指示標準得到較純菌株[14]。

在分離出的菌株培養(yǎng)基中放入濾紙片，選擇潰爛程度高的菌株點接種于剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基[15]，根據(jù)培養(yǎng)基中菌系的直徑大小和群落數(shù)篩選出可降解的純菌株。菌株置于PDA培養(yǎng)基中30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，用含有20%甘油的無菌生理鹽水收集菌體，保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.3

26S rRNA PCR分析。利用北京百泰克生物科技公司真菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株的DNA，采用真菌特異引物擴增。引物序列由上海生工公司合成。DNA擴增結(jié)束后，取3 μL的PCR擴增產(chǎn)物與50 μL溴甲酚藍染料混合均勻后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定1 500 bp處有目的條帶后，交于庫美生物進行測序，然后在NCBI庫上進行序列比對送檢測序，其結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對相似度98%以上則初步判斷為同一菌屬[16]。

1.2.4

復(fù)合菌劑的構(gòu)建。以“1.2.2”中分離提純的5株單一降解菌（AX1、AX3、AM3、AM4、AM5）為對象，將其分別接種至PDA培養(yǎng)基試管中，在無菌蒸餾水中清洗數(shù)次，用濾紙吸干后放入斜面培養(yǎng)基上。接種后的培養(yǎng)基置于15 ℃氣候箱中避光培養(yǎng)。待菌絲長滿斜面，選擇管內(nèi)無雜菌污染的菌種進行轉(zhuǎn)接。在無菌操作條件下挑取菌絲轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，直至斜面長滿菌絲，即獲得純菌種，以此方式活化3次。將活化后的菌株接種到裝有100 mL細菌培養(yǎng)基的三角瓶中，然后在室溫條件下培養(yǎng)7 d，在固體培養(yǎng)基中加入20 mL滅菌生理水溶液，150 r/min搖床振蕩30 min后，2 000 r/min中離心10 min，進行計數(shù)。并用無菌水分別制備菌數(shù)目濃度為1.0×107 CFU/mL。

將5株菌株進行全組合復(fù)配試驗，在無菌操作條件下挑取菌絲交叉劃線，然后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上。15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，如果菌系交叉出現(xiàn)無菌區(qū)，說明它們之間存在拮抗作用。將相互之間無拮抗作用的菌株分別接種至200 mL 的MS培養(yǎng)基中。15 ℃、160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)3 d，1 000 r/min離心后棄上清液收集沉淀菌體，將菌體按一定比例混合制成可降解玉米秸稈復(fù)合菌劑。

1.2.5

秸稈重量及半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量測定。將處理后秸稈56 ℃烘干至恒重，記錄秸稈重量。培養(yǎng)菌液同分解秸稈殘渣用濾紙過濾，56 ℃烘干至恒重，去除濾紙重后得到分解玉米秸稈殘渣重。對比前后秸稈重量，粉碎秸稈，稱取處理前秸稈和秸稈殘渣各0.5 g，裝入專用濾袋中。用濾袋式全自動纖維分析儀（ANKOM 200i，美國安卡姆科技公司）測定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量。具體步驟參考石文卿等[17]方法。

1.2.6

復(fù)合菌系產(chǎn)酶活性的測定。酶活性的測定包括CMCC酶、FDA水解酶和木聚糖酶。以濾紙50 mg、5%羧甲基纖維素鈉、2%微晶纖維素、0.5%水楊苷、1%燕麥木聚糖為底物，使用0.5 g玉米秸稈殘渣液和磷酸緩沖液（pH 7.8）定容至100 mL[18]。

1.2.7

復(fù)合菌系秸稈相對降解率的測定及效果評價。以構(gòu)建的復(fù)合菌系以及“1.2.1”初篩中的降解能力強的單一菌劑為對象，采用失重法檢測復(fù)合菌系對玉米秸稈的相對降解率。試驗稱取500 g土壤，從中取出厚度為5 cm左右的土壤鋪墊于滅菌培養(yǎng)瓶中，再稱取5 g玉米秸稈粉末均勻放置在土壤上，然后于玉米秸稈粉末上均勻倒入單一菌種降解劑和復(fù)合菌種降解劑，再將剩余的土壤覆在秸稈上。試驗設(shè)置秸稈（CK）、秸稈+單菌、秸稈+復(fù)合菌劑，分別標記為J1、J2、J3。用無菌水調(diào)解各個培養(yǎng)基得含水量為650～700 g/kg，每隔24 h保存并測定腐朽過程中物料理化性狀的變化。腐朽處理過程中取出試樣，除掉菌絲和雜質(zhì)，烘干，稱量。烘干恒量時的物質(zhì)即為降解剩余物[19]。秸稈失重率=（m1-m2）/m1×100%，式中，m1為腐朽前培養(yǎng)基中秸稈重量;m2為腐朽后培養(yǎng)基中秸稈的降解剩余物的重量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過tidyverse、reshape進行數(shù)據(jù)處理，采用origin等工具包進行統(tǒng)計分析和相關(guān)性分析，利用origin進行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈降解真菌的篩選與鑒定

在低溫條件下（15 ℃），從污泥中分離得到12株具有秸稈降解能力的真菌，其中AX1、AX3、AM3、AM4、AM5這5株真菌的降解能力好。水解圈試驗和水稻秸稈降解試驗結(jié)果表明，5株真菌在低溫條件下水解圈直徑為15～40 mm，對秸稈有良好的降解能力。菌落形態(tài)表明其屬于不同菌種，對其進行進一步序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明（圖1），AX1為鏈霉菌（Streptomyces），AX3為棘孢木霉（T.asperellum），AM3為鉤狀木霉（T.asperellum），AM4為曲霉（Aspergillus），AM5為青霉（Penicillium）。5株菌株在NCBI庫上進行序列比對送檢測序，其結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對相似度均超過99.5%。

2.2 復(fù)合菌劑的構(gòu)建及酶活分析

以菌絲圈、水解圈出現(xiàn)較早作為篩選的依據(jù)，圖1的結(jié)果可作為初步篩選。選取降解能力較高的5株菌AX1、AX3、AM3、AM4、AM5進行組合。拮抗性結(jié)果表明（表1），菌株AM5對菌株AX1、AX3、AM3、AM4有一定程度的抑制作用;其余菌株之間不存在拮抗性，故采用菌株AX1、AX3、AM3和AM4進行復(fù)合菌劑的構(gòu)建。

從5株菌株的單菌株CMC-Na和濾紙的酶活性（圖2）

可以看出，AX1的CMC-Na酶活性最高，達1 080 IU/mL，AX3次之，為890 IU/mL，然后依次為AM3、AM4、AM5。AX3、AM4的濾紙酶活性顯著高于其他3株菌系，AX3、AM4的濾紙酶活性分別為480、475 IU/mL。由此可見，AX1酶活性表型最佳，AX3次之。

從4種不同豐富度的復(fù)合菌系的平均CMCC酶和平均FDA酶的活性比較（圖3）可以看出，組合三的2種酶的活性均優(yōu)于其他組合的酶活性，其不同時間酶降解活性和穩(wěn)定性都優(yōu)于其他組合，故該研究采用組合三進行后續(xù)試驗。

用濾紙過濾發(fā)酵液，用稀的鹽酸和硝酸混合液反復(fù)緩慢沖洗過濾破碎的濾紙條，而后烘干（80 ℃）稱量，用減重法計算出濾紙失重率。由表2可知，組合三在低溫下降解效果優(yōu)于其他組合。在組合三的4種復(fù)合菌劑組合中：（AX1、AX3、AM3），（AX1、AX3、AM4），（AX1、AM3、AM4），（AX3、AM3、AM4），得到了由AX1、AX3、AM4組合是復(fù)合菌劑中活性降解效果最優(yōu)的復(fù)合菌劑。

2.3 低溫復(fù)合纖維素降解菌株降解效果評價

由表3可知，土培法試驗組中復(fù)合秸稈降解菌劑的失重率明顯高于空白對照和單一菌劑降解組，說明復(fù)合菌劑的降解能力優(yōu)異，需要進一步測定來證實其和單一菌劑的降解性能效果的對照。

由圖4可知，隨著秸稈腐朽試驗的進行，3個培養(yǎng)基的含水量均下降，添加外源菌劑的J3處理（復(fù)合菌劑）和J2處理（單一菌劑）下降速度均高于J1處理（空白對照），其中J3處理效率更高，含水量從702.4 g/kg下降至290.2 g/kg，含水量下降顯著，一定程度上說明復(fù)合菌劑中微生物降解反應(yīng)活躍。3個處理組的pH變化整體趨勢一致，在腐朽試驗初期均大幅升高，在第20天達到最大值，隨后下降，后期趨于穩(wěn)定。其中，J3處理的pH變化幅度最大，至堆肥腐朽結(jié)束，pH穩(wěn)定在6.44左右。

從圖5可以看出，在降解過程中，3個處理組有機質(zhì)含量均呈下降趨勢，J3處理（復(fù)合菌劑）的有機質(zhì)含量下降最為明顯，下降了29.8%，其次為J2處理（單一菌劑），下降了20.5%;降解試驗結(jié)束J1、J2和J3處理的有機質(zhì)含量分別為725.1、577.6、490.6 g/kg。在降解過程中，3個處理組的發(fā)芽指數(shù)均呈明顯的上升趨勢，在整個試驗過程中J3處理的發(fā)芽指數(shù)始終高于J1和J2處理，試驗前期，J3和J2處理的發(fā)芽指數(shù)相差不大，在25 d一直呈交替上升趨勢，至試驗結(jié)束，J3處理的發(fā)芽指數(shù)達到94.45%。

從腐朽過程中全氮、全磷和全鉀含量的變化（表4）可以看出，J2處理（單一菌種）、J3處理（復(fù)合菌劑）腐朽試驗結(jié)束時養(yǎng)分含量均低于初始樣品的養(yǎng)分含量;腐朽試驗結(jié)束時，各個處理的養(yǎng)分含量都有一定程度上的差異，J3處理的全磷、全氮含量明顯低于J1處理（空白對照）和J2處理，J2處理、J3處理全鉀含量差異性很小且J2處理略高。由此可見，J3處理的養(yǎng)分含量低，在低溫（15 ℃）環(huán)境下菌劑的協(xié)同作用使其降解效果能力優(yōu)于單一菌劑。

2.4 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素分解率變化

測定不同時間的培養(yǎng)液中玉米秸稈中的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），纖維素和半纖維素降解趨勢相同，在0～15 d降解速度較快，降解速率呈線性上升，在第15天時，半纖維素、纖維素的降解率分別為27%、26%，在15～30 d降解速度放緩，在第30天時，半纖維素、纖維素的降解率分別為35%、32%。

3 結(jié)論

該試驗探索不同豐富度的復(fù)合菌系多樣性水平和組成對秸稈降解及其纖維素酶活的影響，明確高效降解秸稈的最佳組合，從長白山高海拔處的典型靜水水體污泥中分離獲得5株可低溫降解玉米秸稈的微生物，進一步26S rRNA PCR序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，AX1為鏈霉菌（Streptomyces）、AX3為棘孢木霉（T.asperellum）、AM3為鉤狀木霉（T.asperellum）、AM4為曲霉（Aspergillus）、AM5為青霉（Penicillium），與NCBI數(shù)據(jù)庫的序列相似度均超過99.5%。經(jīng)生物拮抗性試驗，發(fā)現(xiàn)菌株AM5與其他菌株之間產(chǎn)生拮抗作用，用菌株AX1、AX3、AM3、AM4進行復(fù)合菌劑的構(gòu)建。全組合復(fù)配結(jié)果表明，以編號為AX1、AX3、AM4組合的玉米秸稈降解效果最佳、酶活性最高，其構(gòu)建的復(fù)合菌系的降解能力和纖維素酶活性均高于單一菌系，且隨著菌株多樣性水平的增加而提高。

為證實該試驗復(fù)合菌劑的降解能力，進一步利用復(fù)合菌劑和單一菌劑進行對比試驗，結(jié)果表明，復(fù)合菌劑組的養(yǎng)分消耗量大于單一菌劑組，全氮、全磷和全鉀含量比堆肥初始時均有所增加，這是由于微生物的活動導(dǎo)致堆肥的總干物質(zhì)量下降和部分養(yǎng)分的釋放。至堆肥腐朽結(jié)束時，秸稈組各處理間的總養(yǎng)分具有微弱差異，氮、磷、鉀含量均為復(fù)合菌處理>單菌處理>不加菌處理。

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