王增四，高文，陳丹，陳菁，黃丹

(1.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病內(nèi)科，武漢 430022；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，武漢 430030)

糖尿病腎病是歐美發(fā)達國家終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)發(fā)生的主要原因，也是我國慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的第二大病因，目前對糖尿病腎病的防治措施包括控制血糖和血壓、抑制RAS系統(tǒng)激活，而很大一部分患者最終仍將進入ESRD，因此，研發(fā)新的治療藥物顯得尤為重要。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的膜性結(jié)構(gòu)細胞器，在脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)的合成和運輸過程中起核心作用，是調(diào)控炎癥反應(yīng)、細胞凋亡的重要病理通路[1-3]。當(dāng)錯誤蛋白質(zhì)或未折疊蛋白質(zhì)在腔內(nèi)過度堆積、固醇和脂質(zhì)代謝失調(diào)，導(dǎo)致嚴重或持久的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，將影響特定基因表達，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能持續(xù)激活，最終啟動細胞凋亡程序，誘發(fā)糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性病變等疾病[4-7]。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是UPR信號通道共同的下游信號分子，在正常生理狀態(tài)下低表達，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下可大量表達，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中關(guān)鍵的促凋亡因子[8-10]。系膜細胞過度凋亡是造成糖尿病腎病腎小球系膜細胞缺失、基質(zhì)增多的重要原因[11-13]。在高濃度葡萄糖的刺激下，系膜細胞內(nèi)CHOP及其下游信號分子Caspase-3被激活，進而啟動系膜細胞凋亡[14]。改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊功能的伴侶分子可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而延緩糖尿病腎病進展，這種效應(yīng)依賴于其對CHOP蛋白活化的抑制，證實了CHOP誘導(dǎo)的系膜細胞凋亡在糖尿病腎病進展中的關(guān)鍵作用[15-17]。衣霉素可通過抑制UDP-N-乙酰氨基葡萄糖在真核細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移，阻斷N-連接糖基化，破壞蛋白質(zhì)的成熟，通過調(diào)控CHOP等相關(guān)基因表達促進細胞凋亡[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的活性成分黃芪甲苷能改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠蛋白尿，延緩腎功能惡化，并能抑制衣霉素誘導(dǎo)的足細胞凋亡，上述效應(yīng)與黃芪甲苷抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生物學(xué)活性有關(guān)[19-20]。鑒于對CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的系膜細胞凋亡作用的認識，結(jié)合前期對黃芪甲苷改善大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解糖尿病腎病進展的工作基礎(chǔ)，筆者在本研究將觀察黃芪甲苷對衣霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細胞凋亡的影響，并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)標(biāo)志物的表達水平，旨在探討黃芪甲苷腎保護作用的潛在分子機制，并為黃芪甲苷在糖尿病腎病的治療應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗藥物 黃芪甲苷(成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：150202，AS-IV，含量≥98%)，4-苯基丁酸(phenylbutyric acid，PBA，美國Sigma公司，批號：SML0309)，衣霉素(美國Sigma公司，批號：654380)。

1.1.2實驗試劑 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒(InvitrogenTM，批號：V13242)，磷酸化eIF2α、磷酸化IREα、GRP78、CHOP、Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2(美國Abcam公司，批號：ab48187，ab21685，ab179823，ab13847，ab182733，ab196495)，磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)(美國CST公司，批號：3179S)，胎牛血清(FBS，美國Gibco公司，批號：1982185)， 碘化丙啶(上海生工生物工程股份有限公司，批號：批號: A601112)。

1.1.3儀器 流式細胞檢測儀、MiniPROTEAN 3 型Western 電泳儀、DJ2300 型凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad)，酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher)，低溫離心機(美國Beckman)。

1.2系膜細胞培養(yǎng)和干預(yù) 大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心，參照既往方法進行培養(yǎng)。接種于達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM) 培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)，置于細胞培養(yǎng)箱(33 ℃，飽和濕度，5%CO2) 中培養(yǎng)。以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素誘導(dǎo)HBZY-1細胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細胞模型：當(dāng)細胞長至達70%～80%融合后，用無血清DMEM培養(yǎng)液小心漂洗細胞，改用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(用含不同濃度黃芪甲苷或PBA預(yù)處理)14 h后，將衣霉素(5 μg·mL-1)小心加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，細胞模型誘導(dǎo)完成并用于檢測。具體干預(yù)措施如下：正常對照組予以2%FBS+DMEM培養(yǎng)基；模型對照組加入衣霉素5 μg·mL-1；黃芪甲苷小劑量組加入衣霉素5 μg·mL-1+黃芪甲苷50 μg·mL-1；黃芪甲苷大劑量組加入衣霉素5 μg·mL-1+黃芪甲苷100 μg·mL-1；苯丁酸組加入衣霉素5 μg·mL-1+苯丁酸10 mmol·L-1。

1.3流式細胞技術(shù)檢測系膜細胞凋亡 取經(jīng)藥物干預(yù)后的各組系膜細胞，經(jīng)0.25% 胰蛋白酶消化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS )洗滌2 次，調(diào)整細胞密度為1×106·L-1，制成單細胞懸液，加入Binding 緩沖液100 μL和FITC 標(biāo)記的Annexin-V(20 μg·mL-1)10 mL，室溫避光30 min，再加入50 μg·mL-1碘化丙啶5 μL，避光反應(yīng)5 min后，加入Binding 緩沖液400 μL，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測，觀察細胞凋亡情況。

1.4蛋白印跡實驗 取各組系膜細胞，低溫充分勻漿后，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，冰上放置40 min，4 ℃下12 000 r·min-1(r=10 cm)離心10 min，取上清液提取總蛋白，以BCA方法對上清液進行蛋白定量。取蛋白樣品20 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；加入一抗并4 ℃過夜；TBST漂洗后加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后顯色。以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值反映蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1黃芪甲苷對大鼠系膜細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，模型對照組經(jīng)衣霉素干預(yù)后，系膜細胞凋亡率較正常對照組明顯升高(P<0.05)，給予各濃度黃芪甲苷處理后，細胞凋亡率明顯下降，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而黃芪甲苷大劑量組與苯丁酸組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.黃芪甲苷小劑量組；D.黃芪甲苷大劑量組；E苯丁酸組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。圖1 5組系膜細胞凋亡水平的比較A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05．Fig.1 Comparison of apoptosis levels of mesangial cells in five groups

2.2黃芪甲苷對系膜細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通道的影響 與正常對照組比較，模型對照組系膜細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號分子IRE1α、PERK和eIF2α磷酸化水平明顯升高，同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78表達上調(diào)，提示細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強。給予不同濃度黃芪甲苷干預(yù)后，IRE1α、PERK和eIF2α磷酸化水平明顯下降，GRP78表達下調(diào)，這種效應(yīng)在黃芪甲苷大劑量組較顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.黃芪甲苷小劑量組；D.黃芪甲苷大劑量組；E.苯丁酸組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。圖2 5組系膜細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號分子表達水平的比較A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.Fig.2 Comparison of the expression of endoplasmic reticulum stress signal molecules of mesangial cells in different

2.3黃芪甲苷對衣霉素誘導(dǎo)系膜細胞凋亡信號分子的影響 與正常對照組相比，模型對照組細胞CHOP的表達明顯增加，同時，Bax和Cleaved caspase-3的表達顯著上調(diào)，而Bcl-2表達無明顯變化。與模型對照組比較，黃芪甲苷小、大劑量組系膜細胞CHOP表達降低，且Bax和Cleaved caspase-3表達下調(diào)。見圖3。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.黃芪甲苷小劑量組；D.黃芪甲苷大劑量組；E.苯丁酸組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。圖3 5組系膜細胞凋亡相關(guān)信號分子表達水平的比較A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05．Fig.3 Comparison of the expression of apoptosis related signal molecules of mesangial cells in different

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管慢性并發(fā)癥，其病理改變以腎小球病變?yōu)橹鳎缙诒憩F(xiàn)為腎小球系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增加，到中晚期，硬化的腎小球內(nèi)仍存在過多的系膜基質(zhì)，但系膜細胞的數(shù)量呈耗竭狀態(tài)，而過度的細胞凋亡是腎小球系膜細胞缺失的重要原因[21-22]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)多種細胞產(chǎn)生凋亡的關(guān)鍵信號分子：過度表達CHOP能下調(diào)Bcl-2或使Bax轉(zhuǎn)移至線粒體膜而誘發(fā)凋亡[23]；CHOP也可與C/EBPα形成異源二聚體促進Bim蛋白表達而導(dǎo)致凋亡；在高濃度葡萄糖的刺激下，系膜細胞內(nèi)CHOP及其下游信號分子Caspase-3被激活，從而啟動系膜細胞的凋亡，也證實CHOP誘導(dǎo)的系膜細胞凋亡在DN進展中的關(guān)鍵作用[24]。因此，阻斷CHOP介導(dǎo)的系膜細胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的糖尿病腎病進展將是治療的潛在靶點。4-苯基丁酸是一種具有分子伴侶作用的脂肪酸，可通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象、改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白，從而發(fā)揮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，4-苯基丁酸可逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病、梗阻性腎病等疾病模型引起的腎臟纖維化，這種效應(yīng)與其阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制CHOP介導(dǎo)的腎臟系膜細胞、小管間質(zhì)細胞凋亡有關(guān)。 本實驗也觀察到，大鼠系膜細胞在衣霉素干預(yù)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯增強，表現(xiàn)為IRE1α和PERK磷酸化水平升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶分子GRP78上調(diào)，同時，調(diào)控細胞凋亡的CHOP及其下游促凋亡信號的活性明顯增高，導(dǎo)致系膜細胞凋亡率明顯增加，而給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸干預(yù)后系膜細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到抑制，CHOP及其下游促凋亡信號明顯減弱，細胞凋亡率明顯下降。

研究表明，黃芪甲苷能抑制NF-κF活性，減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、MCP-1和ICAM-1表達，減少Ⅳ型膠原α1鏈在腎臟中的沉積，從而緩解糖尿病腎病大鼠的腎臟病變[25]。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠蛋白尿、緩解腎小球硬化，這種效應(yīng)與其改善大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，且這種效應(yīng)不依賴于其對血糖的影響[19]。本實驗進一步證實，黃芪甲苷干預(yù)大鼠系膜細胞后，能有效逆轉(zhuǎn)衣霉素誘導(dǎo)的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時，CHOP及下游的Bax和Cleaved caspase3表達下調(diào)，從而有效抑制衣霉素誘導(dǎo)的系膜細胞過度凋亡，這種效應(yīng)與4-苯基丁酸干預(yù)組相一致。