谷 軍，張曉彥，于德水

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

鏈霉菌是一種應用比較廣泛的微生物，以菌體發(fā)酵產(chǎn)生的刺激代謝產(chǎn)物為主，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)品中多用于生長調(diào)節(jié)抗病毒等制劑。諾爾斯鏈霉菌(streptomyces noursei)是高等的放線菌，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在水稻條紋葉枯病、水稻立枯病、大豆根腐病防治中具有良好的應用效果[1]。

微生物發(fā)酵產(chǎn)品多采用液體深層發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，此工藝和發(fā)酵設備較為成熟，產(chǎn)品純度較高[2-4]，工藝條件容易控制，發(fā)酵罐的體積較大，生產(chǎn)穩(wěn)定。但是液體深層發(fā)酵存在一些缺點，如發(fā)酵產(chǎn)品不能直接使用，需要提取，因而生產(chǎn)成本高，由于排出大量廢水，還需要解決環(huán)境污染問題等。相反，固體發(fā)酵生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品孢子數(shù)高，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物蓄積在發(fā)酵載體中[5]，故而效果更加明顯。近年來，部分產(chǎn)品采用固體發(fā)酵生產(chǎn)，獲得的技術(shù)經(jīng)濟指標都優(yōu)于液體深層發(fā)酵工藝[6]，因此固體發(fā)酵逐漸受到人們的重視，固體發(fā)酵設備也取得了一定的發(fā)展。為了開發(fā)諾爾斯鏈霉菌菌劑產(chǎn)品，需要對該菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件進行研究，促使其實現(xiàn)生產(chǎn)應用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株。諾爾斯鏈霉菌(Streptomyces noursei)，黑龍江省科學院微生物研究所保藏。

培養(yǎng)基。試管培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，KNO30.1%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，瓊脂2%。液體種子培養(yǎng)基：玉米淀粉1%，豆餅粉1% ，NaCL 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.01%。固體種子培養(yǎng)基：玉米粉50 g，麩皮20 g，豆餅粉20 g，稻殼粉10 g，水50 g。

1.2 方法

1.2.1 諾爾斯鏈霉菌固體培養(yǎng)方法

液體種子的培養(yǎng)方法：將100 mL液體種子培養(yǎng)基裝入到500 mL三角瓶中，8層紗布封口，121℃滅菌30 min，冷卻后接入諾爾斯鏈霉菌孢子，30℃，搖床培養(yǎng)3 d，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

固體種子的培養(yǎng)方法：將配好的固體種子培養(yǎng)基50 g裝入到500 mL三角瓶中，瓶口直徑4.5 cm，紗布封口，滅菌冷卻后接入斜面試管菌種，恒溫靜止培養(yǎng)5 d，從第2 d起每天搖晃1次。

分生孢子的計數(shù)方法：測定固體發(fā)酵產(chǎn)品的含水量，精確稱取鏈霉菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品，稀釋定容100 mL，加入到放有玻璃珠的三角瓶中，放入到搖床上震蕩30 min后得到孢子懸液，利用血球計數(shù)器進行孢子量計數(shù)。

諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)：將配好的固體發(fā)酵培養(yǎng)料50 g裝入到500 mL三角瓶中，瓶口直徑4.5 cm，8層紗布封口，121℃滅菌30 min，滅菌冷卻后接入菌種，恒溫靜止培養(yǎng)6～9 d，發(fā)酵溫度為30℃。從第2 d起，為使發(fā)酵均勻，每天搖瓶1次。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初篩

固態(tài)發(fā)酵所用原料廣泛，常為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，以麩皮、玉米粉、稻殼粉、米糠等作為發(fā)酵載體，物料含水量35%，添加一些豆餅粉、無機鹽等進行固體發(fā)酵。采用minitab軟件中Plackat Burman應用，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的幾個因素進行考察。

表1 培養(yǎng)基初篩因素水平表Tab.1 Factor level table of primary screening of medium

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵的重要影響因子，即豆餅粉、麩皮、無機鹽進行優(yōu)化。采用minitab響應面分析功能，對諾爾斯鏈霉菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。試驗安排如表2。

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化因素水平表Tab.2 Factor level table of medium optimization

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

分別檢測不同發(fā)酵時間(6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d)、不同發(fā)酵溫度(24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、不同的物料含水量(20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%)、不同通氣量(500 mL三角瓶物料裝量分別為25 g、50 g、75 g、100 g)、不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%)對固體發(fā)酵產(chǎn)生分生孢子的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾爾斯鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基初篩

分別選取麩皮、米糠、玉米粉、稻殼粉作為發(fā)酵載體，采用正交設計方法進行篩選優(yōu)化。

可以看出，各個因子的效應排序為載體>豆餅粉>麩皮>磷酸二氫鉀>玉米粉>硫酸銨>硫酸鎂。玉米芯粉為負效應。

確定載體為玉米粉，填料為豆餅粉、麩皮、磷酸氫二鉀、硫酸銨。

表3 正交試驗結(jié)果L16(14×27)Tab.3 Results of orthogonal experiment L16(14×27)

圖1 各個因子均值主效應圖Fig.1 Main effect diagram of each factor mean value

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

對諾爾斯鏈霉菌的重要影響因子，即豆餅粉、麩皮、無機鹽，采用minitab軟件中的響應面分析功能進一步確定其最佳的響應濃度。

表4 試驗結(jié)果表Tab.4 Test results

從實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)分析和效應圖中可以看出，主要影響因子排序為：豆餅粉>麩皮>無機鹽。通過軟件分析計算得出，培養(yǎng)基的優(yōu)化組合為豆餅粉6.28%、麩皮10 %、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%，載體為玉米粉。

2.3 不同類型種子對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵的影響

從發(fā)酵結(jié)果看出(圖2)，液體種子和固體種子對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)生分生孢子數(shù)的影響不大。

注：不同字母(a、b)表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 種子類型對固體發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.2 Effect of the results of solid fermentation of seed type

2.4 發(fā)酵時間對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵的影響

在發(fā)酵時間的工藝優(yōu)化試驗中，發(fā)酵試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵產(chǎn)量情況(109cfu/g)Fig.3 Different fermentation time of fermentation production situation(109cfu/g)

從圖3可以看出，發(fā)酵前期(6 d以前)，諾爾斯鏈霉菌主要生長菌絲，第6 d開始產(chǎn)生孢子，第7 d、8 d孢子數(shù)快速成熟，第9 d達到高峰，第10 d、11 d孢子數(shù)增加不顯著。

2.5 發(fā)酵溫度條件對諾爾斯鏈霉菌發(fā)酵的影響

從圖4的諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵結(jié)果可以看出，發(fā)酵溫度對諾爾斯鏈霉菌的生長呈顯著影響， 最適發(fā)酵溫度為30℃。

圖4 不同發(fā)酵溫度對固體發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)果的影響Fig.4 Effect on the results of solid fermentation production of fermentation temperature

2.6 原料含水量對諾爾斯鏈霉菌發(fā)酵的影響

試驗結(jié)果如圖5 所示，在諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵過程中，適宜含水量為25%～35%，35%的含水量實驗效果最好，含水量超過40%，發(fā)酵效果不好。

圖5 原料含水量對固體發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.5 Influence on the results of solid fermentation of the water content of raw materials

2.7 通氣量對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵的影響

在諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵試驗中，研究不同通氣量對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)生孢子的影響，發(fā)酵試驗結(jié)果如圖6。

圖6 不同通氣量的固體發(fā)酵生產(chǎn)情況Fig.6 Solid fermentation production situation of different ventilation rates

從圖6可以看出，通氣量對發(fā)酵結(jié)果有較大的影響，通氣量越大，固體發(fā)酵產(chǎn)生孢子的能力越強。

2.8 接種量對諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵的影響

從圖7可以看出，接種量對發(fā)酵結(jié)果有很大的影響，但在發(fā)酵后期，即第8 d數(shù)據(jù)單因子分析中發(fā)現(xiàn)，接種量4%～10%對發(fā)酵結(jié)果影響不大。

圖7 不同接種量的固體發(fā)酵生產(chǎn)情況Fig.7 Solid fermentation production situation of different inoculation amounts

3 結(jié)果與討論

近年來，諾爾斯鏈霉菌作為生防產(chǎn)品受到越來越廣泛的關(guān)注，采用固體發(fā)酵生產(chǎn)微生物制劑，使用原料為農(nóng)副產(chǎn)品，原料成本較低。固體發(fā)酵過程產(chǎn)生的孢子及微生物生長過程中產(chǎn)生的有益的代謝產(chǎn)物都存在于產(chǎn)品中，因而產(chǎn)品田間使用效果更好。研究表明，諾爾斯鏈霉菌固體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基原料配比為：豆餅粉6.28%、麩皮10.15%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%，載體為玉米粉，水分35%，自然pH值，液體菌種和固體菌種均可，發(fā)酵時間為9 d左右，培養(yǎng)溫度為30℃，可將其用于生產(chǎn)實踐。