張莉莉， 張 軍，馬 驍，張 哲，王明潔，梁文衛(wèi)，高 揚(yáng)

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄉(xiāng)村振興科技研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

0 引言

隨著現(xiàn)代各種不良生活習(xí)慣、生活工作壓力的加大及年齡的增長，人體的酵素會慢慢減少，人體合成及細(xì)菌分泌的酵素只是一少部分，根本滿足不了人體的需要。因此，必須從膳食中攝取更多酵素，而食物經(jīng)過高溫或加工，又使食物中的酵素遭到破壞[1-4]。近年來，隨著人們健康意識的逐漸增強(qiáng)，酵素將成為人們生活中必不可少的新一代健康食品。為進(jìn)一步加大農(nóng)產(chǎn)品加工轉(zhuǎn)化程度，不斷推出新的水果、大糧加工產(chǎn)品，同時也使酵素食品更符合現(xiàn)代人對營養(yǎng)需要的多樣性、平衡性和易于吸收性而研制開發(fā)玉米沙棘復(fù)合酵素產(chǎn)品是必要的[5-8]。制作便捷菜單式玉米復(fù)合酵素產(chǎn)品，縮短培養(yǎng)周期，提高發(fā)酵速率，在最短時間內(nèi)做出高效的復(fù)合酵素產(chǎn)品來[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂玉米粉、白砂糖、蜂蜜、食鹽，市售；沙棘果，本所資源室提供；酵母菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌，北京川秀科技有限公司提供；安琪牌葡萄酒專用高活性干酵母、安琪果蔬酵素發(fā)酵劑，安琪酵母股份有限公司提供；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），中科院微生物研究所提供；白砂糖，黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司提供；SOD酶活力檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸（均為分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；干酪素（分析純），天津市化學(xué)試劑供銷公司提供；L-酪氨酸（分析純），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；福林酚試劑、酚酞（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備與檢測項目

30L型發(fā)酵罐，江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DRH-A100型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海仙象儀器儀表有限公司產(chǎn)品；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；KJM-180型不銹鋼分體式膠體磨，北京錕捷玉誠機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；微波殺菌機(jī)，山東立威微波設(shè)備有限公司產(chǎn)品；WS108型手持糖度計，上海測維光電技術(shù)有限公司產(chǎn)品；EX324型電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；TD5Z型低速平衡離心機(jī)，金壇市城西春蘭試驗儀器廠產(chǎn)品；UV-1100型紫外可見分光光度計，上海凌析達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；HR7633型打漿機(jī)，飛利浦家庭電器（珠海）有限公司產(chǎn)品；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，杭州亞旭生物科技有限公司產(chǎn)品。

總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[11]；可溶性固形物含量的測定：采用折光計法；蛋白酶活力測定：參照GB/T 28715—2012《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定蛋白酶活力[12]；SOD酶活力的測定：酵素液離心取上清液，根據(jù)SOD酶試劑盒說明書進(jìn)行酶活力的測定[13]；數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化法：采用公式（1）進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理[14]。

式中：Y——標(biāo)準(zhǔn)化值；

y——指標(biāo)值；

ymin——指標(biāo)最小值；

ymax——指標(biāo)最大值；

綜合評分法：將各指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重分析，給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，并將各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值與對應(yīng)的權(quán)重系數(shù)相乘后，再進(jìn)行相加作為綜合分?jǐn)?shù)[14]，計算公式（2）如下：

式中：Yi——綜合分?jǐn)?shù)；

Bj——權(quán)重系數(shù)；

Yij——指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值；

i——第i號試驗；

j——第j個指標(biāo)。

1.3 技術(shù)路線

技術(shù)路線（工藝、流程）：脫脂玉米粉+沙棘果酶解液→滅菌→復(fù)合菌發(fā)酵→分離澄清→灌裝→包裝→成品。

1.4 操作要點

（1）原料選擇與處理。脫脂玉米粉1.0~1.5 kg，加入2倍的0.2%亞硫酸凈水溶液于48~50℃下浸泡40~42 h，淋干后備用。選取沙棘果各5~6 kg，挑選、除梗、清洗、淋干（或破碎）酶解后得酶解液滅菌，備用[15]。

（2）調(diào)糖。沙棘酶解液直接添加白砂糖調(diào)整糖度，用手持糖度儀測定糖度，調(diào)整糖度15%~20%。

（3）菌種活化。干酵母加入20倍蒸餾水及5%白砂糖溶解，30~35℃恒溫水浴鍋中活化30 min，備用；植物乳桿菌活化：將斜面保藏的植物乳桿菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化，2次繼代培養(yǎng)后，于37℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，備用。

（4）殺菌。采用巴氏殺菌的方式對原料進(jìn)行殺菌，85℃殺菌25 min后冷卻至室溫。

（5）接種。處理后的原料，按試驗要求的比例接入活化后的植物乳桿菌和酵母菌。

（6）發(fā)酵。處理后原料按1∶1的比例加入發(fā)酵罐內(nèi)，同時加入活化的菌種及1%食鹽、0.15%亞硫酸，于28~32℃溫度下密封發(fā)酵7~30 d，檢測沒有氣體產(chǎn)生，pH值為2~4，即判斷發(fā)酵結(jié)束，經(jīng)分離、過濾得到酵素原液。發(fā)酵結(jié)束后測定蛋白酶活力與SOD酶活力。

（7）調(diào)整后熟。如果酸度過高，加入降酸酵母；如糖度過低可用白砂糖、木糖醇調(diào)整；如風(fēng)味欠佳可加入植物香料。調(diào)整后的原液于25℃條件下進(jìn)行后熟，經(jīng)過30~35 d即可。

（8）調(diào)配。經(jīng)過后熟的原液加入4%~8%白砂糖、0.8%~1.2%蜂蜜，調(diào)配后過濾。

（9）灌裝。在無菌條件下灌裝，包裝即為成品。

1.5 試驗方法

1.5.1 發(fā)酵溫度

為確定復(fù)合菌在玉米沙棘發(fā)酵液中的最佳發(fā)酵溫度，在保證發(fā)酵液充分溶氧的條件下，復(fù)合菌接種量為0.2%，分別控制發(fā)酵溫度為21，23，25，27，29℃，然后進(jìn)行復(fù)合菌發(fā)酵，發(fā)酵時間為15 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，確定最佳的酵母菌發(fā)酵溫度。

1.5.2 起始pH值

試驗所用的復(fù)合菌種適宜在酸性環(huán)境下生長。為確定復(fù)合菌在玉米沙棘發(fā)酵液中的最佳發(fā)酵溫度，保證發(fā)酵液充分溶氧，控制發(fā)酵溫度為25℃，酵母菌接種量為0.2%，用CaCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸度，分別調(diào)節(jié)pH值在4.0，4.5，5.0，5.5，6.0條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間為15 d。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，確定最適的發(fā)酵起始pH值。

1.5.3 接種量的確定

對玉米沙棘果發(fā)酵液來說，復(fù)合菌接種量不同，發(fā)酵液發(fā)酵的快慢就不同，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)和質(zhì)量。為確定復(fù)合菌在玉米沙棘發(fā)酵液中的最佳發(fā)酵溫度，保證發(fā)酵液充分溶氧，控制發(fā)酵溫度為25℃，pH值設(shè)定為5.0，分別接種0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%復(fù)合菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間為15 d。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，確定最佳的復(fù)合菌接種量。

1.5.4 發(fā)酵時間的確定

為確定復(fù)合菌在玉米沙棘發(fā)酵液中的最佳發(fā)酵時間，保證發(fā)酵液充分溶氧，控制發(fā)酵溫度為25℃，復(fù)合菌接種量為0.25%，pH值為4.0，發(fā)酵時間分別設(shè)置為6，9，12，15，18 d，發(fā)酵結(jié)束后測定沙棘果渣發(fā)酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，以確定最佳的酵母菌發(fā)酵時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對SOD活力和蛋白酶活性的影響

發(fā)酵溫度25℃時，發(fā)酵15 d后測得SOD活力高達(dá)153 U/mL，蛋白酶活性48.21 U/mL。這與酵母菌本身適宜生長的溫度有關(guān)。

2.1.2 起始pH值的確定

起始pH值對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 起始pH值對SOD活力和蛋白酶活性的影響

玉米沙棘發(fā)酵液起始pH值5.0時效果最佳，復(fù)合菌在pH值5.0時生長狀態(tài)最佳，在此條件下SOD活力高達(dá)133 U/mL，蛋白酶活性40.32 U/mL。

2.1.3 接種量的確定

復(fù)合菌接種量對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對SOD活力和蛋白酶活性的影響

圖3 復(fù)合菌接種量對SOD活力和蛋白酶活性的影響

復(fù)合菌接種量為0.25%時，發(fā)酵15 d后測得SOD活力高達(dá)183 U/mL，蛋白酶活性44.20 U/mL。

2.1.4 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖4。

沙棘果渣發(fā)酵液在發(fā)酵15 d結(jié)束時，SOD活力高達(dá)209 U/mL，蛋白酶活性45.35 U/mL。第16天開始，酶活性逐漸降低，可能是由于發(fā)酵初期糖源供應(yīng)充足，酵母菌好氧發(fā)酵需要糖源源不斷地供應(yīng)，隨著發(fā)酵時間的延長發(fā)酵液中的糖源被消耗，發(fā)酵末期糖源供應(yīng)不足，發(fā)酵活力降低，影響了酶活力。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝試驗

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1，Box-behnken試驗方案及試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

根據(jù)表2的試驗結(jié)果，將蛋白酶活性和SOD活力的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，蛋白酶活性的權(quán)重系數(shù)為0.4，SOD活力的權(quán)重系數(shù)為0.6。得出相應(yīng)的綜合分?jǐn)?shù)Y，并作為總指標(biāo)進(jìn)行試驗結(jié)果分析。

表2 Box-behnken試驗方案及試驗結(jié)果

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

由表3中F值大小可知，各因素對綜合分的影響程度的主次關(guān)系為X4＞X3＞X2＞X1，即接種量＞發(fā)酵時間＞pH值＞發(fā)酵溫度。由于各因素與綜合分之間的影響并不是簡單的線性關(guān)系，為了更明確各因素與綜合分Y的關(guān)系，通過SAS9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)曲面回歸模型為：

典型分析見表4。

表4 典型分析

對響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行回歸與方差分析，由表4可知，失擬項不顯著，回歸項顯著；且該模型R2=95.76%，R2Adj=90.82%，說明試驗設(shè)計所獲得的數(shù)學(xué)回歸方程與試驗結(jié)果能夠較好地進(jìn)行擬合，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系較為顯著。各因素對綜合分的影響程度的主次關(guān)系為X4＞X3＞X2＞X1，即接種量＞發(fā)酵時間＞pH值＞發(fā)酵溫度。

由表4可知，4個因素的特征值都為負(fù)，表明有極值。由SAS9.1軟件分析，得出各因素最優(yōu)的水平組合為X1=0.083 85，X2=0.183 92，X3=0.151 83，X4=0.577 92，考慮到實際工藝過程的操作情況，對各因素的最優(yōu)水平進(jìn)行修正，即X1=0，X2=0，X3=0，X4=0.5，修正后的優(yōu)化工藝條件為發(fā)酵溫度25℃，pH值5.0，發(fā)酵時間15 d，接種量0.275%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗初步確定玉米沙棘復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝條件，在此基礎(chǔ)上以蛋白酶活性和SOD酶活性為主要指標(biāo)，將蛋白酶活性和SOD酶活性的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，在權(quán)重系數(shù)的分配上，蛋白酶活性權(quán)重系數(shù)為0.4，SOD活力的權(quán)重系數(shù)為0.6。采用響應(yīng)曲面法中的Box-behnken模式，得出各因素對綜合分的影響程度的主次關(guān)系為X4＞X3＞X2＞X1，即接種量＞發(fā)酵時間＞pH值＞發(fā)酵溫度，通過二次回歸設(shè)計優(yōu)化玉米沙棘復(fù)合酵素發(fā)酵工藝的最佳條件為發(fā)酵溫度25℃，pH值5.0，發(fā)酵時間15 d，接種量0.275%。